清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠ERK1/2 磷酸化的影響*

史曉偉，王一強(qiáng)，張玉香，姜德民，王鳳麗，王干一，陳有源，王俊喹

( 1. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050; 2. 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 3.蘭州市安寧區(qū)醫(yī)院，甘肅 蘭州 730060； 4.西和縣中醫(yī)院，甘肅 西和 742100)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝臟中脂肪過(guò)度沉積和肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征、且無(wú)過(guò)量飲酒史、排除其他肝特異性病因的臨床常見(jiàn)疾病[1]，為肝細(xì)胞性肝硬化的重要病因[2]，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[3]，病情嚴(yán)重程度與越來(lái)越多的危險(xiǎn)因素相關(guān)[4]。到目前為止，還沒(méi)有一種針對(duì)NAFLD的治療被證明是普遍有效的[5]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療NAFLD方面發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，具有多靶點(diǎn)治療、安全可靠的特點(diǎn)，但作用機(jī)制尚不完全明確。本研究通過(guò)觀察清肝祛濕活血方對(duì)NAFLD大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、游離脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、肝臟細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)、肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1c)表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明中藥復(fù)方治療NAFLD的部分機(jī)制、揭示作用靶點(diǎn)，完善中醫(yī)藥防治NAFLD的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

選取同批健康SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，10周齡，體質(zhì)量(150±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證: SYXK(甘)2011-0001)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫18～20 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲用自來(lái)水。

1.2 藥品、試劑與儀器

清肝祛濕活血方處方組成：夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g。中藥煎劑由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備，諸藥材由蘭州方正醫(yī)藥有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿(商品名：易善復(fù))，由賽諾菲安萬(wàn)特北京制藥有限公司提供，批號(hào)：090266。Rat Insulin ELISA試劑盒(批號(hào)E02I0004)和Rat P-ERK1/2 ELISA試劑盒(批號(hào)E02P0049)，購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司；Phospho-SREBP 1c Antibody試劑盒(批號(hào)9874)，購(gòu)自美國(guó)CST中國(guó)分公司產(chǎn)品；FFA ELISA試劑盒(批號(hào)TWp003228)和TG ELISA試劑盒(批號(hào)TWp028103)，購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。5417R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)EPPENDORF公司產(chǎn)品；BIO-TEK ELX800酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；ELITE流式細(xì)胞儀，美國(guó)BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與造模

將90只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組，各組15只。正常對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)；其余各組根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法，予高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射四環(huán)素造模。

造模成功后，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組依次予清肝祛濕活血方生藥5.63，11.25，22.5 g/(kg·d)灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予多烯磷脂酰膽堿550 μg/(g·d)，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組予生理鹽水 10 μL/(g·d)灌胃，連續(xù)給藥 30 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察、對(duì)比各組大鼠的一般情況。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前大鼠空腹至少 8 h，經(jīng)鼠尾靜脈采血，使用博士血糖儀測(cè)定FPG。經(jīng)眶后靜脈叢采血，離心取上清，凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)FINS、FFA和TG，并根據(jù)FPG及FINS計(jì)算出胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。HOMA-IR=胰島素水平(μIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。取肝臟組織，采用ELISA法測(cè)定肝臟ERK1/2，蛋白印記法檢測(cè)肝臟SREBP-1c表達(dá)。操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)清肝祛濕活血方高劑量組死亡 2只大鼠，中劑量組死亡1只大鼠，解剖后發(fā)現(xiàn)是灌胃不當(dāng)導(dǎo)致窒息而亡。

2.1 各組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，清肝祛濕活血方各組FPG、FINS和HOMA-IR均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，多烯磷脂酰膽堿組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，清肝祛濕活血方3個(gè)劑量組FPG和FINS水平均明顯下降， HOMA-IR改善明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。說(shuō)明清肝祛濕活血方能夠顯著改善NAFLD大鼠血糖代謝，胰島功能及胰島素抵抗。見(jiàn)表1。

組別動(dòng)物數(shù)/只FPG/(mmol·L-1)FINS/(μIU·L-1)HOMA-IR正常對(duì)照組155.47±1.259.35±6.712.84±0.78模型對(duì)照組1513.07±3.43***46.85±13.28***23.75±5.61***多烯磷脂酰膽堿組1512.82±2.93#42.63±10.16#22.76±4.14#清肝祛濕活血方低劑量組159.75±1.55##△△30.24±8.64##△△13.63±2.85##△△清肝祛濕活血方中劑量組148.68±1.41##△△26.52±9.17##△△10.42±2.56##△△清肝祛濕活血方高劑量組137.52±1.24###△△△22.80±6.43###△△△7.38±1.44###△△△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P>0.05，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 各組大鼠血清FFA、TG對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清FFA和TG均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，多烯磷脂酰膽堿組和清肝祛濕活血方各組大鼠血清FFA和TG均明顯下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，清肝祛濕活血方低、中劑量組大鼠血清FFA和TG差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，清肝祛濕活血方大劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明清肝祛濕活血方能夠改善NAFLD大鼠血脂代謝。見(jiàn)表2。

組 別動(dòng)物數(shù)FFA/(μmol·L-1)TG/(mmol·L-1)正常對(duì)照組1562.24±4.561.21±0.08模型對(duì)照組15220.58±7.14***3.14±0.22***多烯磷脂酰膽堿組15125.32±5.71##1.82±0.17##清肝祛濕活血方低劑量組15136.82±5.13###△2.26±0.21##△清肝祛濕活血方中劑量組14117.36±4.92##△1.79±0.22##△清肝祛濕活血方高劑量組1387.42 ± 4.55###△△1.64±0.13###△△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，△P>0.05，△△P<0.05

2.3 各組大鼠肝臟組織ERK1/2、SREBP-1c表達(dá)對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組ERK1/2磷酸化增加，SREBP-1c表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，多烯磷脂酰膽堿組和清肝祛濕活血方各組ERK1/2和SREBP-1c下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，清肝祛濕活血方低、中劑量組ERK1/2磷酸化和SREBP-1c表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，清肝祛濕活血方大劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明清肝祛濕活血方能夠降低NAFLD大鼠肝臟內(nèi)ERK1/2磷酸化，改善SREBP-1c過(guò)度表達(dá)。見(jiàn)表3。

組 別動(dòng)物數(shù)ERK1/2/(μg· L-1)SREBP-1c/(mg·L-1)正常對(duì)照組154.16±0.580.38±0.06模型對(duì)照組156.12±0.84***1.24±0.23***多烯磷脂酰膽堿組155.48±0.53##0.76±0.13##清肝祛濕活血方低劑量組155.52±0.61##△0.72±0.10##△清肝祛濕活血方中劑量組145.10±0.49##△0.62±0.11##△清肝祛濕活血方高劑量組134.76±0.68###△△0.54±0.09###△△

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對(duì)比，△P>0.05，△△P<0.05

3 討 論

非酒精性脂肪肝屬中醫(yī)學(xué)“脅痛”“肝著”“積聚”“肝癖”等范疇?！斗蔷凭灾拘愿尾≈嗅t(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)(2017)》[7]認(rèn)為NAFLD或因飲食不節(jié)、或因情志失調(diào)、或因稟賦不足、或因勞逸失度、或因久病體虛而導(dǎo)致肝體陰用陽(yáng)的功能失調(diào)、脾腎虧虛，痰、濕、濁、瘀、熱等病理產(chǎn)物積聚而發(fā)??；病位在肝，涉及脾、腎等臟腑；臨床推薦按照濕濁內(nèi)停證、肝郁脾虛證、濕熱蘊(yùn)結(jié)證、痰瘀互結(jié)證、脾腎兩虛證5個(gè)分型辨證論治。目前研究[8]認(rèn)為，中藥治療NAFLD的主要作用機(jī)制為調(diào)節(jié)脂肪組織分泌和儲(chǔ)存、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等。本課題組認(rèn)為肝經(jīng)濕熱瘀阻為NAFLD的主要病機(jī)，依此病機(jī)自創(chuàng)清肝祛濕活血方，由夏枯草、垂盆草、郁金、茵陳、丹參、密蒙花、青葙子、炙甘草等組成。方中夏枯草、垂盆草、郁金清肝祛濕、活血化瘀，為君藥；茵陳助垂盆草清利肝膽濕熱，丹參助郁金涼血活血，為臣藥；密蒙花、青葙子清肝涼血，為佐藥。全方共奏清肝祛濕、活血化瘀之效。前期臨床研究[9]表明：此方具有改善非酒精性脂肪肝患者臨床癥狀，降低體重指數(shù)、腰圍，改善肝功能和胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血脂代謝的作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10]發(fā)現(xiàn)其能夠下調(diào)NAFLD大鼠肝臟固醇調(diào)節(jié)SREBP-1c表達(dá)。

西醫(yī)學(xué)[11]認(rèn)為二次打擊學(xué)說(shuō)是NAFLD的主要發(fā)病機(jī)制，其中游離脂肪酸和胰島素抵抗是主要因素。SREBP-1c是主要表達(dá)于肝臟和脂肪細(xì)胞中的亞型，可調(diào)節(jié)三酰甘油和磷脂的合成、儲(chǔ)存，其過(guò)度表達(dá)會(huì)調(diào)節(jié)靶基脂肪酸合酶合成增加。脂肪酸合酶是脂肪酸(FA)合成的關(guān)鍵酶，F(xiàn)A能抑制胰島素受體底物胰島素受體底物1的磷酸化，同時(shí)下調(diào)胰島素受體底物2的轉(zhuǎn)錄水平，抑制胰島素信號(hào)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致胰島素抵抗[12-13]，形成NAFLD。ERK1/2可通過(guò)調(diào)節(jié)SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子的核成熟而刺激脂肪酸合酶的表達(dá)，且SREBP-1c的表達(dá)量隨著ERK1/2磷酸化的增加而增多[14]。本研究顯示，清肝祛濕活血方可有效減少SREBP-1c表達(dá)和細(xì)胞外信號(hào)ERK1/2磷酸化，降低NAFLD大鼠FFA、TG、FPG、FINS和HOMA-IR，改善胰島素抵抗。由此表明，清肝祛濕活血方治療非酒精性脂肪肝的部分機(jī)制是通過(guò)改善ERK1/2過(guò)度磷酸化，降低SREBP-1c表達(dá)，從而調(diào)節(jié)糖、脂代謝，改善胰島素抵抗來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究尚未開(kāi)展清肝祛濕活血方對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響干預(yù)的研究，是否是清肝祛濕活血方通過(guò)降低FA，從而影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而致胰島素抵抗還有待進(jìn)一步研究。