不同產(chǎn)地砂仁總酚測定及抗氧化活性比較△

鄒曉紅，曹騁，曾元兒，江濱

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

砂仁為姜科植物陽春砂AmomumvillosumLour.、綠殼砂AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen或海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu的干燥成熟果實(shí)，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效[1]。對于砂仁化學(xué)成分的研究多集中于揮發(fā)油部分，對其他非揮發(fā)性成分的研究較少[2-3]。砂仁中除含有大量的揮發(fā)性成分外，還包括酚類、黃酮類、多糖、無機(jī)物等多種非揮發(fā)性成分[3-5]。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于砂仁總酚的相關(guān)研究報(bào)道，僅有陳程等[5]對陽春砂仁的酚性成分進(jìn)行了相關(guān)研究。尤小梅等[6]比較了春砂仁根、葉提取物與茶多酚的抗氧化活性，唐建陽等[7]、劉金鵬[8]探究了砂仁的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)各提取物具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基活性。隨著國家日益重視大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]，砂仁作為藥食兩用的藥材，有必要深入探討其所含的各種化學(xué)成分及藥效。本論文從砂仁的非揮發(fā)性成分著手，通過建立福林酚比色法測定砂仁的總酚含量，并測定其對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力和鐵離子的還原能力來評價(jià)砂仁的抗氧化活性，完善砂仁酚性成分的研究，為砂仁酚性成分的深入研究與開發(fā)應(yīng)用、以及更全面地評價(jià)砂仁藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器：L5S紫外可見分光光度計(jì)(INESA)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所)；AEG-200型分析天平(SHIMADZU)；BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius)。Multiskan G0酶標(biāo)儀(Thermo SCIENTIFIC)，移液槍(Sartotius)。

試藥：本實(shí)驗(yàn)用砂仁樣品的來源見表1。所有砂仁樣品由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定其品種。

表1 24批砂仁樣品信息

香草酸對照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：151116，純度大于98%)，福林酚試劑(上海荔達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：PRLB09250)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH試劑)(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：W09A7E12633)；奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)(aladdin，批號(hào)：F1624018)；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)(Beyotime，編號(hào)：S0119)；總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)(Beyotime，編號(hào)：S0116)，色譜甲醇(Merck公司)，超純水。其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 砂仁總酚提取及含量測定

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取香草酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取砂仁樣品，去殼，搗碎，過二號(hào)篩。取粉末約2 g，精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，加20%甲醇70 mL，稱定質(zhì)量。回流提取60 min，放冷后稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，收集濾液，即得。

2.1.3 總酚的測定 精密移取供試品溶液適量，置25 mL量瓶中，加福林酚試劑1.5 mL，靜置5 min，加10% Na2CO3溶液7.5 mL，加水定容，混勻，暗處放置1 h，以試劑空白為參比，于735 nm波長處測定吸光度值。

2.2 砂仁總酚抗氧化活性測定

2.2.1 DPPH法 取DPPH試劑和Trolox標(biāo)準(zhǔn)品，分別加甲醇配制成158.07 μmol·L-1的DPPH溶液和1.9 mmol·L-1的Trolox母液。參照文獻(xiàn)方法[10-11]，設(shè)對照組、樣品組、樣品對照組和空白組。往96孔板中加入相應(yīng)的試劑混合，對照組為10 μL甲醇+200 μL DPPH試劑；樣品組為10 μL樣品+200 μL DPPH試劑；樣品對照組和空白組分別加入樣品溶液和甲醇試劑以排除自身的干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL系列濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μL DPPH試劑。各組均重復(fù)3次，輕輕混勻。避光反應(yīng)20 min，于酶標(biāo)儀517 nm處測定其吸光度(A)值。按公式(1)計(jì)算清除率(R)。

R(%)=[1-(Ax-Ax0)/(A1-A0)]×100

(1)

式中：A1為對照組值，Ax為樣品組值，Ax0為樣品對照組值，A0為空白組值。

2.2.2 ABTS法 參照總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)的總抗氧化能力的測定方法，往96孔板中加入相應(yīng)的試劑混合，對照組為10 μL蒸餾水+200 μL ABTS工作液；樣品組為10 μL樣品+200 μL ABTS工作液；樣品對照組和空白組分別加入樣品溶液和蒸餾水以排除自身的干擾。標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入10 μL系列濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μL ABTS工作液。各組均重復(fù)3次，輕輕混勻。室溫孵育15 min后于酶標(biāo)儀734 nm下測定吸光度。按公式(1)計(jì)算清除率。

2.2.3 FRAP法 參照總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)的總抗氧化能力的測定方法，往96孔板中加入相應(yīng)的試劑混合，對照組為5 μL蒸餾水+180 μL FRAP工作液；樣品組為5 μL樣品+180 μL FRAP工作液；樣品對照組和空白組分別加入樣品溶液和蒸餾水以排除自身的干擾。標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔內(nèi)加入5 μL系列濃度的FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液和180 μL FRAP工作液。各組均重復(fù)3次，輕輕混勻。室溫孵育40 min后于酶標(biāo)儀593 nm下測定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 砂仁總酚含量測定方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下香草酸對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色并測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=67.92X+0.102 8，r=0.999 5；線性范圍為0.002 0～0.011 9 mg·mL-1。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下香草酸對照品溶液，照2.1.3項(xiàng)下方法顯色，測定吸光度值，連續(xù)測定5次，計(jì)算吸光度的RSD為0.3%(n=5)，表明儀器的精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取云南金平縣黃?？松叭?S1)供試品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法顯色，分別于制備后0、1、2、3、4 h測定其吸光度，計(jì)算吸光度的RSD=0.9%(n=5)，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取云南金平縣黃?？松叭蕵悠?S1)，分別按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行5份，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測定吸光度值，計(jì)算吸光度的RSD為1.9%(n=5)，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取云南金平縣黃牛克砂仁樣品(S1)0.30 g，平行6份，精密稱定，置圓底燒瓶中，每份精密加入新配制的香草酸對照品溶液(0.500 7 mg·mL-1)2 mL，按2.1.2項(xiàng)下制備供試品溶液方法操作提取，再按2.1.3項(xiàng)下方法，精密移取供試品溶液6 mL，依次加入顯色劑進(jìn)行顯色并測定吸光度值，結(jié)果見表2，計(jì)算得平均加樣回收率為96.6%(RSD=3.3%，n=6)，表明該法回收率較好。

表2 砂仁中香草酸加樣回收率試驗(yàn)

注：對照品加入量為1.001 4 mg。

3.1.6 總酚含量測定結(jié)果 按照2.1.2項(xiàng)制備供試品溶液，對24批不同產(chǎn)地的砂仁藥材按2.1.3項(xiàng)方法進(jìn)行總酚的含量測定，結(jié)果見表3。

表3 24批砂仁樣品的總酚含量測定結(jié)果，n=5)

3.2 砂仁總酚抗氧化測定結(jié)果

3.2.1 DPPH法 按照2.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行DPPH自由基清除能力測定，并以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)、清除率為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=118.41X+2.559 5，r=0.999 3；線性范圍為0.08～0.70 mmol·L-1。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品對DPPH自由基的清除率，結(jié)合樣品的稀釋倍數(shù)，轉(zhuǎn)化為達(dá)到一定濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度，也把該方法稱為TEAC(Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity)法[12-13]，即樣品混合物與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品對DPPH自由基具有相同的清除率所對應(yīng)的Trolox濃度值，測定結(jié)果見表4。

3.2.2 ABTS法 按照2.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行ABTS自由基清除能力測定，并以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)、清除率為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=85.35X-0.566，r=0.999 7；線性范圍為0.05～0.80 mmol·L-1。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品對ABTS自由基的清除率，結(jié)合樣品的稀釋倍數(shù)，用TEAC法表示樣品的抗氧化能力，測定結(jié)果見表4。

3.2.3 FRAP法 按照2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行鐵離子還原能力測定，并以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=0.291 2X+0.066 8，r=0.999 6；線性范圍為0.5～3.0 mmol·L-1。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品對鐵離子還原能力，結(jié)合樣品的稀釋倍數(shù)，用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示樣品的抗氧化能力，結(jié)果見表4。

3.3 不同產(chǎn)地砂仁總酚含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

不同產(chǎn)地的砂仁總酚含量呈正態(tài)分布，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20軟件對其含量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明各不同產(chǎn)地的砂仁總酚含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。其中總酚含量最高的為購于愛店口岸的老撾砂仁(S18)，為44.02 mg·g-1；含量最低的為云南金平縣黃?？说纳叭?S1)，為3.41 mg·g-1；兩者之間相差約12.9倍。通過質(zhì)心聚類法對不同產(chǎn)地的砂仁樣品總酚的含量進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用平方歐氏距離(Squared Euclidean Distance)獲得聚類分析結(jié)果，見圖1。由聚類分析樹狀圖可以看出，24批不同產(chǎn)地的砂仁被分成兩大類，其中總酚含量較高的4批砂仁(S7、S17、S18、S22)歸為一類，其余批次的砂仁歸為另一類?？傮w來看，進(jìn)口砂仁的總酚含量普遍較高，次之為綠殼砂與云南西雙版納一帶的陽春砂，而陽春道地產(chǎn)區(qū)和云南紅河一帶引種的陽春砂總酚含量較低。提示砂仁中總酚含量與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。

表4 砂仁總酚抗氧化活性結(jié)果，n=3) mmol·L-1

圖1 24批不同產(chǎn)地砂仁總酚含量聚類分析樹狀圖

3.4 砂仁總酚與其抗氧化活性的相關(guān)性分析

以24批砂仁的總酚含量與其對應(yīng)的DPPH、ABTS、FRAP法測定的抗氧化活性分別做相關(guān)性分析，得相關(guān)系數(shù)分別為0.966，0.966，0.927。結(jié)果顯示，3種不同方法測定的抗氧化活性均與總酚含量呈正相關(guān)(P<0.01)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用福林酚比色法測定砂仁的總酚含量，通過全波長掃描確定最大吸收波長為735 nm；并通過實(shí)驗(yàn)探索得顯色體系各試劑的用量，當(dāng)福林酚試劑與10%Na2CO3溶液的體積比為1∶5、福林酚試劑用量為1.5 mL時(shí)吸光度具有最大值；測定顯色體系20～120 min的吸光度變化，發(fā)現(xiàn)顯色時(shí)間達(dá)到40 min后吸光度值穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇60 min作為顯色完全的最佳反應(yīng)時(shí)間。在總酚的測定過程中，由于不同產(chǎn)地的砂仁總酚含量差距較大，為了控制吸光度值在0.2～0.8以減小誤差，加入的供試品溶液量在0.2～2.0 mL。

含量測定結(jié)果顯示不同產(chǎn)地總酚含量在3.41～44.02 mg·g-1，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。酚類成分多具有抗氧化、清除自由基、抑菌等作用，相關(guān)研究報(bào)道日益增多[14-15]，砂仁是否具有此類藥效作用值得我們進(jìn)一步去研究。此次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的砂仁均具有一定的抗氧化活性，DPPH法的TEAC值在0.31～8.09 mmol·L-1，ABTS法的TEAC值在0.45～11.56 mmol·L-1，F(xiàn)RAP法的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在0.66～10.03 mmol·L-1。3種方法測定的抗氧化活性均與總酚含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r>0.9，揭示其化學(xué)成分活性可能具有相似性。不同產(chǎn)地的砂仁總酚含量以及其抗氧化活性均高低不一，要確保其臨床療效，需要對其含量及具體成分做進(jìn)一步的研究和控制。砂仁作為藥食兩用的藥材，其產(chǎn)量低、用量大、價(jià)格不斷攀高，有必要去豐富其化學(xué)成分基礎(chǔ)知識(shí)，充分挖掘利用其藥用價(jià)值，為更全面地評價(jià)砂仁藥材的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以便砂仁在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到更充分的開發(fā)應(yīng)用。