斑馬魚(yú)體內(nèi)氧化損傷標(biāo)志物篩選

李嘉蔚，胡雪菲，韓 鵬，陳呢喃，陸一鳴

1)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中法生命科學(xué)和基因組研究中心 上海 200025 2)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院急診科 上海 200025 3)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院急診科 上海 200025

氧化應(yīng)激參與了糖尿病酮癥酸中毒[1]、百草枯中毒[2-3]等多種急診工作中常見(jiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展。人類端粒由于富含鳥(niǎo)嘌呤，且存在3’單鏈突出結(jié)構(gòu)，易受到氧化損傷；由于端粒結(jié)合蛋白復(fù)合體的保護(hù)作用，端粒受到氧化損傷后不能啟動(dòng)DNA損傷應(yīng)答 (DNA damage response，DDR)通路，無(wú)法完成損傷的修復(fù)，因此端粒很可能是氧化損傷的重要靶點(diǎn)[4]。在端粒結(jié)合蛋白復(fù)合體的蛋白組分中，端粒重復(fù)結(jié)合因子2(teomere repeat binding factor 2，TRF2)的功能最為重要，它的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致端粒功能障礙[5]；端粒功能障礙會(huì)導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高[6]。基于此，本研究采用TRF2基因敲除(TRF2-/-)斑馬魚(yú)胚胎作為氧化損傷模型(TRF2-/-斑馬魚(yú)胚胎可能會(huì)出現(xiàn)小腦、小眼、脊柱側(cè)彎與心包水腫等氧化損傷相關(guān)畸形)，探討TRF2是否能夠影響氧化應(yīng)激相關(guān)基因山松醇RNA結(jié)合蛋白家族3(pumilio RNA binding family member 3，PUM3)、神經(jīng)元中蛋白激酶和酪蛋白激酶底物3(protein kinase C and casein kinase substrate in neuron 3，PACSIN3)的表達(dá)，篩選以端粒為靶點(diǎn)的氧化損傷標(biāo)志物，為以后的臨床決策提供參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑Trizol、RNA過(guò)柱純化試劑盒、SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Ambion公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，2×SuperReal Premix Plus(With SYBER Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理采用本課題組保存的TRF2雜合子(TRF2+/-)斑馬魚(yú)進(jìn)行自交。將后代胚胎飼養(yǎng)至3個(gè)月大小，剪尾抽提DNA，PCR后進(jìn)行測(cè)序鑒定篩選TRF2-/-斑馬魚(yú)。TRF2-/-斑馬魚(yú)自交獲得TRF2-/-斑馬魚(yú)胚胎。野生型斑馬魚(yú)胚胎組作為對(duì)照組，TRF2基因敲除斑馬魚(yú)(TRF2-/-)作為實(shí)驗(yàn)組。每組取30條存活胚胎進(jìn)行RNA抽提，獲得RNA。

1.3斑馬魚(yú)胚胎中TRF2、PUM3、PACSIN3mRNA表達(dá)的RT-qPCR檢測(cè)使用Invitrogen公司的Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)抽提斑馬魚(yú)胚胎總RNA，并采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR引物序列如下：PUM3上游序列5’-GCGTCT

TCAGTTGTGGAATAC-3’,下游序列5’-CATCCAAGATGCT-CTCCAATTT-3’；TRF2 上游序列5’-TCAGGATAACTGGAGTGATGAG-3’,下游序列 5’-AGTGTCCCACACCATAGC-3’；β-actin上游序列5’-CCGTATGCAGA-AGGAAATCAC-3’，下游序列5’-GGTGGCAACAGTTCTGTTTAG-3’；PACSIN3上游序列5’-GAGACCAAAGATGCTGATGAAG-3’，PACSIN3下游序列5’-GGTACATTTCTCTAGGCGATCT-3’。RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min； 95 ℃ 10 s，61 ℃ 20s ，72 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算采用2-ΔΔCT法[7]。

1.4斑馬魚(yú)pCS2-PUM3、pCS2-PACSIN3載體的構(gòu)建斑馬魚(yú)PUM3、PACSIN3編碼序列全長(zhǎng)由PCR法擴(kuò)增得到。 PUM3 PCR引物的EcoRⅠ上游序列：5’-CATCGATTCGAATTCATGGAGGGTAAACCAAGAAG-3’，XhoⅠ下游序列：5’-TTCTAGAGGCTCGAGATTATGCAAGTTTTTCAAGCAGAAC-3’， PACSIN3 PCR引物的EcoRⅠ上游序列：5’-CATCGATTCGAATTCATGTCTTCCAACGGTGATCGC-3’，XhoⅠ下游序列：5’-TTCTAGAGGCTCGAGTCAGCAACTCTTCTCCTTCTCCTC-3’。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pCS2質(zhì)粒中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、挑選菌落、菌落擴(kuò)增、質(zhì)粒小量抽提后，將載體交由上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序鑒定。

1.5載體的體外轉(zhuǎn)錄與顯微注射采用Ambion公司SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒按照使用說(shuō)明書(shū)對(duì)構(gòu)建成功載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)以及本次線性化載體濃度，使用線性化載體6 μL(約300 ng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄完成并采用Ambion公司RNA過(guò)柱純化試劑盒純化后，將PUM3、PACSIN3 mRNA顯微注射至TRF2-/-斑馬魚(yú)受精卵中。每個(gè)受精卵約注射5.5 ng mRNA。將斑馬魚(yú)受精卵置于平板培養(yǎng)皿中，加入適量蛋水，并置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中正常發(fā)育。使用間氨基苯甲酸乙酯將斑馬魚(yú)幼魚(yú)麻醉后顯微鏡下觀察斑馬魚(yú)是否畸形。斑馬魚(yú)中出現(xiàn)小腦、小眼、脊柱側(cè)彎或心包水腫或出現(xiàn)多種者被認(rèn)為是畸形斑馬魚(yú)。統(tǒng)計(jì)注射組與未注射組TRF2-/-斑馬魚(yú)畸形率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0進(jìn)行分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較野生型和TRF2-/-斑馬魚(yú)胚胎中TRF2、PUM3、PACSIN3基因相對(duì)表達(dá)量的差異，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)比較注射組與未注射組TRF2-/-斑馬魚(yú)畸形率的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1野生型和TRF2-/-斑馬魚(yú)胚胎中TRF2、PUM3、PACSIN3mRNA的表達(dá)見(jiàn)表1。

表1 野生型和TRF2-/-斑馬魚(yú)胚胎中TRF2、PUM3、PACSIN3 mRNA的表達(dá)(n=30)

2.2pCS2-PUM3、pCS2-PACSIN3載體體外轉(zhuǎn)錄及mRNA顯微注射對(duì)TRF2-/-斑馬魚(yú)畸形率的影響

注射PUM3 mRNA組共注射94個(gè)TRF2-/-受精卵，成活85條。在存活的斑馬魚(yú)中，畸形斑馬魚(yú)共14條，畸形率約為16.5%。注射PACSIN3 mRNA組共注射85個(gè)TRF2-/-受精卵，成活79條。在成活的斑馬魚(yú)中，畸形斑馬魚(yú)共15條，畸形率約為19.0%。對(duì)照組共137個(gè)TRF2-/-受精卵，成活122條。在成活的斑馬魚(yú)中，畸形斑馬魚(yú)共36條，畸形率約為29.5%。與對(duì)照組相比，注射PUM3 mRNA斑馬魚(yú)畸形率顯著下降(χ2=4.648，P=0.031)，注射PACSIN3 mRNA斑馬魚(yú)畸形率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.803，P=0.094)。

3 討論

糖尿病酮癥酸中毒是糖尿病病人最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是急診工作中常見(jiàn)的疾病。該病可引起大腦、腎等重要臟器的損傷[8]，嚴(yán)重時(shí)甚至可導(dǎo)致患者死亡[9]。該病同時(shí)伴有系統(tǒng)性氧化應(yīng)激，是病情加劇的十分重要的原因[10]。百草枯是一種氧化劑，中毒后可引起以肺為主要靶器官的多臟器功能損害：通過(guò)在肺組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，來(lái)破壞肺泡毛細(xì)血管、肺泡上皮細(xì)胞等，最終可引起患者呼吸衰竭而死亡[11]。如果能夠篩選出理想的氧化損傷標(biāo)志物，則可能可以在病情發(fā)展過(guò)程中預(yù)報(bào)氧化損傷，從而有利于疾病的干預(yù)。端?？赡苁茄趸瘬p傷的重要靶點(diǎn)，因此，以端粒為靶點(diǎn)，有可能可以篩選出合適的氧化損傷標(biāo)志物，進(jìn)而可能可以用來(lái)早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)報(bào)氧化損傷。然而，目前國(guó)內(nèi)外氧化損傷標(biāo)志物篩選研究[12-13]較多，但以端粒為靶點(diǎn)的氧化損傷標(biāo)志物研究較少，因此本研究一定程度上彌補(bǔ)了該領(lǐng)域研究的空白。

研究[14-15]表明，TRF2能結(jié)合端粒外的端粒間質(zhì)重復(fù)序列(interstitial telomeric sequence，ITS)來(lái)調(diào)控附近相關(guān)基因的表達(dá)，提示TRF2不但具有結(jié)合、保護(hù)端粒的作用，同時(shí)可能具有反式作用因子的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，野生型斑馬魚(yú)胚胎中PUM3、PACSIN3 mRNA的表達(dá)高于TRF2-/-斑馬魚(yú)，提示TRF2能影響斑馬魚(yú)胚胎中PUM3、PACSIN3 mRNA的表達(dá)。結(jié)合上述研究[14-15]結(jié)果，提示TRF2可能通過(guò)結(jié)合這些基因的ITS序列來(lái)影響它們的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，PUM3能補(bǔ)救TRF2缺失造成的氧化損傷相關(guān)器官畸形，PACSIN3可能能補(bǔ)救TRF2缺失造成的氧化損傷相關(guān)器官畸形，表明PUM3、PACSIN3表達(dá)量的降低可能是加重斑馬魚(yú)器官氧化損傷的一個(gè)重要原因。提示臨床上通過(guò)檢測(cè)患者TRF2、PUM3、PACSIN3水平可能可以作為即將發(fā)生氧化損傷的標(biāo)志，用來(lái)早期預(yù)報(bào)氧化應(yīng)激導(dǎo)致器官損傷，或可能通過(guò)檢測(cè)血液等組織TRF2、PUM3、PACSIN3水平來(lái)預(yù)報(bào)體內(nèi)發(fā)生的氧化損傷，但具體臨床應(yīng)用尚需更多證據(jù)。

本研究存在局限性：①TRF2影響PUM3、PACSIN3表達(dá)的確切機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。②本研究采用斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，未取人類樣本進(jìn)行研究。雖然斑馬魚(yú)與人類基因同源性高達(dá)87%，但研究結(jié)果尚無(wú)法應(yīng)用于臨床。具體臨床應(yīng)用尚需更多研究。

總之，臨床上通過(guò)檢測(cè)TRF2、PUM3、PACSIN3表達(dá)水平有望早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)報(bào)氧化應(yīng)激，并有望成為提高臨床療效的靶點(diǎn)。