極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療嚴重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠實驗研究

鐘 瑩,王占科,周方強,胡 添,王慶蒞,郭 靚

多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是指在嚴重創(chuàng)傷、感染和休克后，傷前無器官功能不全患者同時或相繼出現(xiàn)2個或2個以上器官功能不全的綜合征[1-2]。嚴重燒(燙)傷作為嚴重的創(chuàng)傷，并發(fā)MODS涉及全身性感染炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及糖代謝紊亂導致的高血糖和高乳酸血癥，晚期病死率高，是住院燒傷患者死亡的主要原因，早期發(fā)現(xiàn)和綜合干預(yù)創(chuàng)傷后MODS是降低住院患者病死率的有效手段[3-6]。文獻報道，胰島素和丙酮酸乙酯均具有抗炎和抗氧化作用,且聯(lián)合治療較單獨治療效果好[7]。極化液主要成分為胰島素、葡萄糖和氯化鉀，是心血管內(nèi)科一種傳統(tǒng)藥物[8]。極化液和胰島素不完全相同，丙酮酸鈉和丙酮酸乙酯也有根本不同的性質(zhì)，二者聯(lián)合治療嚴重創(chuàng)傷MODS實驗研究報道較少。本研究探討極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療嚴重創(chuàng)傷MODS作用機制，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及材料 清潔級健康成年SD大鼠，體重(200±15)g，雌雄各半[江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2016-0001，質(zhì)量合格證號1308116]；胰島素注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：3.0 ml：300 U)；丙酮酸鈉(美國sigma公司，分析純)；內(nèi)毒素[Lipopolysaccharide(LPS), E.coli O111:B4，美國sigma公司,分析純]。血可溶性髓樣細胞觸發(fā)蛋白1(sTREM-1)和高遷移率族蛋白B1(HMGB-l)等炎性因子和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒均由美國Sigma公司生產(chǎn)。MDA化學比色法檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒均購自福建新大陸生物技術(shù)股份有限公司。血糖(GLU)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血肌酐(CRE)和血肌酸激酶(CK)生化檢測試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2儀器 TDZ4B-WS型離心機從湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司購買；HH-W21型電熱恒溫水浴箱從上海醫(yī)用恒溫設(shè)備有限公司購買；JB-1型全自動快速立式洗板機從鄭州基波新科技有限公司購買；BIO-RAD550型酶標儀購自美國伯樂BIO-RAD公司；BS2000型全自動生化分析儀由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)。

1.3動物模型制作和分組 80只清潔級健康成年SD大鼠無菌包裝條件下，運輸?shù)浇夥跑?4醫(yī)院動物實驗室[實驗室許可證SYXK(贛)2013-001]清潔級大鼠實驗環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，燙傷前1 d進行尾靜脈采血，然后根據(jù)參考文獻[7]進行麻醉后背部剪毛，浸入(92.0±2.0)℃水中20 s，制作30%體表面積(TBSA)Ⅲ度燙傷，傷后2 h按5 mg/kg體重腹腔注射內(nèi)毒素(1.0 mg/ml,5.0 ml/kg)，同時腹腔注射生理鹽水3.0 ml抗休克。燙傷大鼠傷后1 d并發(fā)肝功能、腎功能和心肌酶等指標明顯高于傷前，并持續(xù)到傷后7 d，為創(chuàng)傷MODS模型制作成功。將制備后的嚴重燙傷內(nèi)毒素血癥MODS動物模型，按隨機數(shù)字表法分為極化液治療組(GIK組)、丙酮酸鈉治療組(SP組)、極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組(GIK+SP組)及對照組,每組20只。

1.4給藥劑量和途徑 GIK組：參考文獻[9]配制葡萄糖、胰島素和氯化鉀終濃度分別為100 g/L、80 U/L和5 g/L極化液治療溶液，胰島素和葡萄糖治療劑量分別為5.6 U/(kg·d)和7.0 g/(kg·d),傷后6 h,腹腔注射1次，然后每8小時腹腔注射1次,連續(xù)7 d。SP組：用生理鹽水配制丙酮酸鈉終濃度為0.25 g/L的丙酮酸治療液，按12.5 mg/(kg·d)治療劑量，傷后6 h腹腔注射1次，然后每8小時腹腔注射1次,連續(xù)7 d。GIK+SP組：極化液和丙酮酸鈉治療劑量和治療時間分別同GIK組和SP組，先腹腔注射丙酮酸鈉溶液，隨后注射極化液溶液。對照組：只注射生理鹽水，其他同GIK組。各組大鼠雌雄比，傷前體重，喂食和飲水條件相同，腹腔注射溶液總體積相同，均為3 ml。丙酮酸鈉溶液需臨時配制，放冰箱4℃保存，配制后當天內(nèi)使用。

1.5樣品采集及測定指標 各組燙傷大鼠，參考文獻[10]分別于傷前，傷后1、3、5和7 d進行尾靜脈采血，采血前禁食8 h但可以自由飲水，肝素鈉抗凝，離心后，分離血漿，-80℃超低溫液氮罐內(nèi)保存。標本相關(guān)指標檢測時，各組血液標本統(tǒng)一凍融，嚴格按照各指標檢測試劑盒說明書測定。空腹GLU、LA、ALT、CRE和CK及SOD測定采用酶法，血漿MDA測定采用化學終點比色法在全自動生化分析儀上進行測定。血漿sTREM-1和HMGB1采用ELISA檢測法在酶標儀上進行測定。所有指標質(zhì)控均在控，標本檢測濃度在標準曲線的線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1大鼠存活情況 對照組大鼠傷后7 d存活14只，存活率為70%；SP組和GIK組傷后7 d均存活16只，存活率均為80%，GIK+SP組傷后7 d存活17只，存活率為85%。4組傷后7 d大鼠存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠傷后不同時間存活情況(只)

注：GIK組為極化液對照組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK組+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水

2.2大鼠GLU和主要臟器功能指標情況 4組傷后各時點GLU、ALT、CK和CRE高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK組、SP組和GIK+SP組傷后各時點ALT、CK和CRE均低于對照組，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK+SP組和GIK組傷后各時點GLU低于SP組和對照組(P<0.01)，GIK+SP組和GIK組GLU比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組嚴重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠GLU、ALT、CRE和CK水平變化

注：GLU為血糖，ALT為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，CRE為血肌酐，CK為血肌酸激酶；GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01;與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

2.3血乳酸、丙酮酸水平變化 4組傷后各時點血LA、PA和LA/PA均高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK+SP組、GIK組、SP組傷后各時點血LA和LA/PA水平均低于對照組，且GIK+SP組傷后各時點LA和LA/PA水平低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK+SP、GIK、SP組傷后各時點血PA高于對照組(P<0.01)，但GIK+SP、GIK、SP組血PA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4大鼠血漿sTREM-1和HMGB1水平變化 4組傷后各時點血漿sTREM-1和HMGB1水平均高于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點血漿sTREM-1和HMGB1水平均低于對照組(P<0.01)，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)。見表4。

2.5大鼠血漿MDA和SOD水平變化 4組傷后各時相點血漿MDA含量高于傷前，SOD低于傷前(P<0.01)，并持續(xù)到傷后7 d；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點血漿MDA含量均低于對照組，且GIK+SP組低于GIK組和SP組(P<0.01)；GIK、SP和GIK+SP組傷后各時點血漿SOD水平均高于治療對照組，且GIK+SP組高于GIK組和SP組(P<0.01)。見表5。

表3 4組嚴重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血LA、PA和LA/PA水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；LA為乳酸，PA為丙酮酸；與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

表4 4組嚴重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血漿sTREM-1和HMGB1水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組；sTREM-1為血可溶性髓樣細胞觸發(fā)蛋白1，HMGB-l為高遷移率族蛋白B1;與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

表5 4組嚴重燙傷多器官功能不全綜合征大鼠血漿MDA和SOD水平變化

注：GIK組為極化液治療組，SP組為丙酮酸鈉治療組，GIK+SP組為極化液和丙酮酸鈉聯(lián)合治療組，對照組僅給予生理鹽水；MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶;與傷前比較，bP<0.01；與對照組比較，dP<0.01；與GIK組比較，fP<0.01；與SP組比較，hP<0.01

3 討論

極化液基本成分為葡萄糖、胰島素和氯化鉀，不同成分發(fā)揮不同作用，葡萄糖為機體提供營養(yǎng)和能量，胰島素刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT)的細胞內(nèi)移位和活性，調(diào)節(jié)葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活力，促進葡萄糖的有效轉(zhuǎn)運和代謝利用。葡萄糖和胰島素都能刺激細胞膜上鈉-鉀泵(Na+-K+-ATPase)活性，在促進葡萄糖轉(zhuǎn)運同時也增進鉀離子由細胞外泵向細胞內(nèi)，降低血鉀濃度，因此，輸注葡萄糖同時輸注氯化鉀可避免輸注葡萄糖引起的低鉀血癥[11-12]。

文獻報道，胰島素不僅用于控制糖尿病患者高血糖，還可用于外科手術(shù)后及嚴重感染炎癥危重病患者高血糖控制，抗氧化與抗炎癥效果良好[13-18]。嚴重創(chuàng)傷患者血糖水平不一定升高，極化液不僅用于嚴重創(chuàng)傷高血糖患者，也可用于嚴重創(chuàng)傷正常血糖患者，其作為葡萄糖和胰島素聯(lián)合制劑較單純胰島素治療更具有廣泛的適應(yīng)證。極化液在創(chuàng)傷患者應(yīng)用過程中，應(yīng)密切觀察血鉀和血糖水平，及時調(diào)整葡萄糖和氯化鉀用量[9]。

嚴重創(chuàng)傷后并發(fā)高血糖、高乳酸血癥及LA/PA比值升高，加劇MODS發(fā)生與發(fā)展，高乳酸血癥可作為評估嚴重創(chuàng)傷、敗血癥和休克等危重病預(yù)后的重要指標[19-20]。本研究結(jié)果表明，極化液治療可降低嚴重創(chuàng)傷內(nèi)毒素血癥MODS大鼠空腹GLU、LA和LA/PA比值等糖代謝障礙指標和氧化還原勢能減低的相關(guān)指標，提示極化液治療不僅能改善糖代謝障礙還能夠控制高乳酸血癥。血sTREM-1是細胞膜TREM-1游離的可溶性片段，可作為創(chuàng)傷患者早期感染標記物，膜TREM-1屬于內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導相關(guān)受體蛋白，內(nèi)毒素與膜TREM-1啟動機體炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)機體腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等多種炎性細胞因子升高。HMGB-1是一種晚期升高敏感的感染炎性細胞因子，嚴重創(chuàng)傷感染者血HMGB-1升高[21-22]。本研究結(jié)果顯示，極化液治療可降低嚴重創(chuàng)傷內(nèi)毒素血癥MODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平，提示極化液有良好抗炎作用。血MDA升高伴隨SOD活力下降是評估機體氧化應(yīng)激程度的重要實驗室指標[23]。本研究結(jié)果顯示，極化液可降低嚴重燒傷MODS大鼠血MDA水平，提高SOD活力，提示極化液也有抗氧化作用。極化液抗氧化機制可能與胰島素直接抗炎和降低高血糖及糾正糖代謝障礙和改善機體營養(yǎng)有關(guān)。

PA是體內(nèi)天然小分子物質(zhì)，是葡萄糖代謝中間產(chǎn)物，也是葡萄糖代謝生成大量ATP三羧酸循環(huán)原料乙酰輔酶A的前提物質(zhì)，內(nèi)源性PA參與全身各組織和器官細胞三大物質(zhì)能量代謝。丙酮酸鈉易溶于水，在體內(nèi)通過結(jié)合氧和氮自由基，直接發(fā)揮強有力的抗氧化作用，也可通過提高細胞內(nèi)氧化還原勢能，間接發(fā)揮抗氧化功能[24-25]。近年文獻報道，丙酮酸鹽無論經(jīng)靜脈、腹腔或口服途徑，在致死性休克復蘇中能提高細胞的缺氧耐受性，都有顯著的多器官保護和糾正糖代謝紊亂的作用，并有效逆轉(zhuǎn)缺氧型乳酸性酸中毒，成倍提高實驗動物生存率[26-27]。

本研究結(jié)果顯示，丙酮酸鈉治療可明顯降低嚴重燒傷MODS大鼠血LA和LA/PA比值等指標，提示丙酮酸鈉具有控制高乳酸血癥的功能。本研究結(jié)果還表明，丙酮酸鈉和GIK治療均明顯提高血PA濃度，說明丙酮酸鈉降低LA/PA比值主要與降低LA水平和提高PA水平有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸鈉治療可顯著降低嚴重燒傷MODS大鼠血sTREM-1、HMGB-1水平,也可以顯著降低MDA水平和提高血SOD活力，進一步說明丙酮酸鈉和極化液一樣具有有力的拮抗嚴重創(chuàng)傷MODS過度炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激效果。丙酮酸鈉和極化液也具有類似的抑制高乳酸血癥作用,但因未觀察酸中毒指標，丙酮酸鈉是否對糾正危重的乳酸性酸中毒，或合并治療有更好的效果,尚有待觀察。需要指出的是本文所用丙酮酸鈉治療劑量為12.5 mg/(kg·d),屬于超小劑量治療，盡管結(jié)果顯示其具有控制高乳酸血癥和有力的抗氧化與抗炎作用，但不能完全糾正高乳酸血癥和逆轉(zhuǎn)LA/PA比值，可能與使用劑量小有關(guān)。丙酮酸鈉不同治療劑量療效評估值得進一步研究。

雖然丙酮酸乙酯也具有抗炎和抗氧化作用[24]，但丙酮酸鈉和丙酮酸乙酯有本質(zhì)不同， 丙酮酸鈉是鹽類，在體內(nèi)天然存在，而丙酮酸乙酯是酯類，并不存在于體內(nèi)。盡管二者都能糾正高乳酸血癥，并具備抗氧化和抗炎作用，但丙酮酸乙酯并不同時具備糾正代謝性酸中毒的作用，水溶液并不穩(wěn)定,二期臨床試驗已經(jīng)失敗[28]。丙酮酸鈉的實驗和臨床研究國內(nèi)外已有多項報道，其大劑量輸注顯示安全無毒性[29]。糾正高乳酸血癥、控制炎癥和氧化應(yīng)激是治療危重病患者的重要措施，臨床需求迫切性值得深入探討丙酮酸鹽的潛在作用，丙酮酸鈉相對丙酮酸乙酯更具有臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)前景。

綜上所述，嚴重創(chuàng)傷MODS患者往往需要綜合治療，極化液和丙酮酸鈉均作為人體內(nèi)天然存在的成分，二者聯(lián)合治療效果值得研究。胰島素、葡萄糖和丙酮酸鈉在糾正高乳酸血癥、抗炎和抗氧化方面，可能存在協(xié)同促進作用，胰島素不僅促進葡萄糖生成丙酮酸，并進一步促進丙酮酸代謝和三羧酸循環(huán)生成大量ATP，深入的作用機制值得進一步探討。