薄層色譜掃描法測定桑白皮中桑辛素含量△

劉一涵，田云剛，王建霞，向芳芳，魏華，2*

(1.吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；2.湖南省土家醫(yī)藥研究中心，湖南 吉首 416000)

桑白皮(Mori Cortex)為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)為《中華人民共和國藥典》2015版收載的常用中藥，具有瀉肺平喘，利水消腫之功效，主要治療肺熱喘咳，水腫脹滿尿少，面目肌膚浮腫[1]?；瘜W(xué)成分研究表明，桑白皮中含有Diels-Alder型加合物、黃酮類、二苯乙烯類、2-芳基苯并呋喃類、多羥基生物堿類及其他類的多種化學(xué)成分。藥理研究表明，桑白皮具有降血壓、降血脂、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗HIV、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物等多種藥理作用[2-3]。桑辛素(morusin)，也稱桑根皮素，是從桑白皮中分離出的一種異戊烯類黃酮，具有抗腫瘤、抗炎[4]、抗氧化、降糖[5]、降血脂[6]、鎮(zhèn)痛[7]、抗痙攣[8]、抑膽堿脂酶[9]及其他[10]等多方面的藥理活性，是極具開發(fā)價值的藥物先導(dǎo)化合物和桑白皮中可能的主要指標(biāo)性成分。近年來，對于桑辛素的含量測定已有部分報(bào)道[11-14]，但這些方法中有的代價較大、有的步驟繁瑣、有的耗時耗力。因此，為了克服前人分析方法的不足，有必要采用一種靈敏、高效和低廉的分析方法。本研究采用簡單、易行的雙波長薄層色譜掃描法對不同產(chǎn)地桑白皮中桑辛素的含量進(jìn)行測定，一方面為桑白皮中桑辛素的質(zhì)量控制提供了一種新的參考方法，另一方面為桑白皮的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CAMAG SCANNER 3型薄層掃描儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG SANMPLER 4型全自動點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG ADC2自動展開缸(瑞士卡瑪公司)，25 μL進(jìn)樣針(瑞士卡瑪公司)，AG285電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)，不同規(guī)格硅膠GF254預(yù)制板(青島海洋化工廠)，LD-4臺式離心機(jī)(常州天瑞儀器有限公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BZF 50型真空干燥箱(Boxun)。

1.2 材料

桑辛素對照品自制(純度達(dá)98%以上)。桑白皮藥材購買或采集，經(jīng)吉首大學(xué)魏華副教授鑒定為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮，藥材產(chǎn)地見表1。試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定10.0 mg桑辛素對照品，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，取1 mg·mL溶液1 mL再定容至10 mL，稀釋為0.1 mg·mL-1，即為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取桑白皮樣品粉末(過60目篩)0.5 g，精密稱定，加甲醇，料液比為1∶10，超聲波輔助提取30 min，4000 r·min-1離心10min取上清液，此法提取四次，合并上清液、濃縮，甲醇溶解并定容至5 mL，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，濾液備用。

2.3 薄層色譜分離、掃描條件

點(diǎn)樣條件：取0.1 mg·mL-1對照品溶液和供試品溶液3 μL于GF254薄層板上條帶點(diǎn)樣，點(diǎn)樣速度：150 nL·s-1，樣點(diǎn)寬度：6 mm，點(diǎn)樣基線距底邊10 mm，樣點(diǎn)距邊緣20 mm，樣點(diǎn)間距為10.6 mm。

層析條件：以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(1.5∶0.8∶1)為展開劑，溫度為(25±3) ℃，濕度為50%～55%，展開槽內(nèi)放飽和濾紙飽和30 min，上行展開，展至約9 cm處。取出晾干后置于UV254 nm下檢視，供試品色譜中含有與對照品相應(yīng)的暗斑，且與其他組分完全分離，可進(jìn)行定量分析(圖1)。

注：R表示桑辛素對照品，1～10樣品信息見表1。圖1 桑辛素對照品及10批樣品薄層色譜圖(254 nm)

掃描條件：將層析后的對照品和供試品在200～700 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果二者均在273 nm處有最大吸收(圖2)，故選擇掃描波長為λS=273 nm，λR=500 nm，狹縫：0.4 mm×0.2 mm，掃描速度：20 mm·s-1，反射式鋸齒形掃描。以斑點(diǎn)峰面積隨行外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含量(圖3)。

2.4 精密度試驗(yàn)

同板精密度：取低濃度對照品在同一硅膠板上平行點(diǎn)樣6個點(diǎn)，每點(diǎn)均為3 μL，依法展開，晾干，掃描，測得桑辛素含量RSD為1.21%(n=6)，結(jié)果表明，同板精密度良好。

表1 10批藥材中桑辛素含量測定結(jié)果(n=4)

圖2 薄層掃描色譜圖

圖3 對照品及10批樣品薄層掃描3D圖譜

異板精密度：取低濃度對照品溶液于不同薄層板上各點(diǎn)樣3 μL，依法展開，測得桑辛素含量RSD為2.30%(n=6)，結(jié)果表明，異板精密度良好。

2.5 檢測限和定量限實(shí)驗(yàn)

精密吸取對照品適量，在同一薄層板上分別點(diǎn)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μL，每個點(diǎn)平行3次，依法展開、掃描，進(jìn)行檢測限與定量限測定。分別以信噪比(S /N)為3時和信噪比(S/N)為10時的點(diǎn)樣作為檢測限和定量限。結(jié)果桑辛素的檢測限為20 ng，定量限為40 ng。

2.6 線性關(guān)系考察

用全自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)0.1 mg·mL-1對照品溶液2.0、2.5、4.0、6.0、8.0、10.0、10.5、11.0 μL于同一硅膠GF254薄層板上，按上述薄層色譜條件展開，掃描測定，以斑點(diǎn)峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對照品點(diǎn)樣量X(ng)為橫坐標(biāo)計(jì)算桑辛素含量的回歸方程：Y=5 814.491+40.320X，r=0.999 1，sdv=2.04%。結(jié)果表明，桑辛素點(diǎn)樣量在200～1100 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，如圖4。

圖4 桑辛素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在同一GF254硅膠板上交叉點(diǎn)供試品和對照品，展開，每隔20 min掃描一次，持續(xù)2 h，結(jié)果表明，桑辛素斑點(diǎn)峰面積值至少在2 h內(nèi)基本保持不變，RSD=2.10%(n=7)，穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取2號藥材5份，各0.5 g，按2.2項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，各溶液點(diǎn)樣、展開、掃描，測得桑辛素含量RSD為2.80%，表明重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱定已知含量的藥材5份，各0.25 g，精密加入1 mg·mL-1對照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下供試品處理方法操作，得回收率供試品，依法測定含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率測定結(jié)果

2.10 樣品含量測定

按2.2項(xiàng)下的方法制備10批桑白皮藥材的供試溶液，用全自動點(diǎn)樣儀交叉點(diǎn)樣對照品和供試品溶液適量，按2.3項(xiàng)下方法展開、晾干、掃描測定10批桑白皮藥材中桑辛素的含量。結(jié)果見表2。10批樣品中桑辛素含量在0.737～1.599 mg·g-1范圍內(nèi)，其中四川綿陽野生樣品中桑辛素含量最高，云南栽培樣品中桑辛素含量其次，桑辛素含量最高與最低的樣品相差超過2倍。

3 討論

目前，《中華人民共和國藥典》2015版中所記載的桑白皮無規(guī)定的含量測定指標(biāo)性成分[1]，而桑辛素具有多種重要的藥理作用，且其含量較為可觀，因此，有望成為桑白皮中指標(biāo)性成分之一。已有報(bào)道的關(guān)于桑白皮中桑辛素含量的測定方法主要有HPLC、UPLC和紫外分光光度法。其中，HPLC和UPLC精密度高，但流動相選擇范圍較窄，每次只能測定一個樣品且分析耗時較長，數(shù)據(jù)處理較慢；紫外分光光度法操作較為繁瑣，耗時長，對其他干擾較為敏感。

本研究采用薄層色譜掃描法測定的桑辛素，其在UV254 nm下可見清晰暗斑，故點(diǎn)樣于GF254薄層板上無需顯色，可直接定性觀察和定量掃描。在耗時約半小時，于20 cm×10 cm薄層板上可一次性成功分離、鑒別和測定18個不同樣品中的桑辛素，且試驗(yàn)中使用全自動點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，能很好控制點(diǎn)樣量，減小實(shí)驗(yàn)誤差。與其他方法相比較，薄層掃描法可在同一薄層板上同時分離、分析多個樣品；靈敏度高，適于分析小量樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、方便更換；固定相為一次性使用，對樣品的預(yù)處理要求低；軟件自帶數(shù)據(jù)處理，結(jié)果準(zhǔn)確、快速。因此，本方法是一種簡單、快速和廉價的方法，是HPLC法、UPLC法的重要補(bǔ)充。適合于桑辛素的常規(guī)分析，可作為桑白皮中桑辛素含量控制的新的參考方法。