同位素稀釋-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中10種合成麝香

周 靜，張曉嵐，徐紅斌

(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，環(huán)境污染與健康研究所，上海 200444)

麝香是化妝品的重要原料之一，被廣泛用于香水、花露水、剃須水、膏霜等產(chǎn)品中。由于天然麝香的資源有限，19世紀(jì)末，Baur等[1]首次合成了硝基麝香。合成麝香香味獨(dú)特、定香能力好，逐漸成為香精香料行業(yè)中天然麝香的廉價(jià)替代物。合成麝香主要分為硝基麝香、多環(huán)麝香和大環(huán)麝香3類。由于大環(huán)麝香的制造工藝復(fù)雜、成本高，在香精香料行業(yè)中應(yīng)用很少，而硝基麝香和多環(huán)麝香大約占了該行業(yè)中95%以上的市場份額。合成麝香具有較強(qiáng)的親脂憎水性，在環(huán)境中難降解，易生物富集，對(duì)生物和人體均呈現(xiàn)一定的生物毒性，易滲入人體細(xì)胞且具有疑似的致癌性[2-4]。因此，美國及歐盟的許多國家已將其列為高關(guān)注物質(zhì)，并禁止或限制將其用于化妝品及與皮膚接觸的產(chǎn)品中[5-7]。我國2015年修訂的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[8]中明確：將傘花麝香、葵子麝香和西藏麝香列為禁用物質(zhì)，另規(guī)定了酮麝香的使用限量為香水1.4%、淡香水0.56%、其他0.042%；二甲苯麝香的限量為香水1.0%、淡香水0.4%、其他0.03%。GB/T 22731—2017《日化香精》[9]中除了上述禁用的3種麝香外，將二甲苯麝香和萬山麝香也列在禁用名單中。然而，目前還沒有日化產(chǎn)品中合成麝香的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，給行政執(zhí)法及進(jìn)出口貿(mào)易帶來不便。因此，建立準(zhǔn)確、快速、靈敏的化妝品中合成麝香的分析方法十分必要。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的化妝品中合成麝香分析方法的研究主要集中于禁、限用的硝基麝香。測定方法多以氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)法[10-12]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法[13-16]為主。質(zhì)譜法可以彌補(bǔ)色譜法無法分離復(fù)雜組分和假陽性的缺點(diǎn)，同時(shí)縮短合成麝香的分離時(shí)間。與單級(jí)質(zhì)譜相比，串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式具有更強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力和定性、定量準(zhǔn)確性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)化妝品中合成麝香的準(zhǔn)確測定。馬強(qiáng)等[13]報(bào)道了固相萃取-同位素稀釋-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中的二甲苯麝香；王征[14]和鄭小嚴(yán)[15]采用GC-MS/MS法測定了化妝品中5種硝基麝香類化合物；葉洪等[16]應(yīng)用GC-MS/MS法測定了個(gè)人護(hù)理品中9種合成麝香；Dong等[17]采用載體輔助液液萃取和固相萃取的前處理技術(shù)，結(jié)合GC-MS/MS法實(shí)現(xiàn)了膏霜中7種人工合成麝香的同時(shí)測定。還有一些研究者運(yùn)用GC-MS/MS開發(fā)了水產(chǎn)品和空氣等樣品中多種合成麝香的同時(shí)檢測方法[18-20]。然而，以上檢測方法存在前處理復(fù)雜或樣品基質(zhì)單一等問題。如葉洪等[16]開發(fā)的檢測方法僅適用于測定沐浴露、洗發(fā)露、洗衣液等液體類樣品，且采用熒蒽-D10作為內(nèi)標(biāo)物，與麝香類物質(zhì)的理化性質(zhì)存在一定差異，無法真實(shí)地反映方法的有效性與準(zhǔn)確性。Dong等[17]的研究僅涉及膏霜類樣品，且前處理相對(duì)繁雜，不利于方法的標(biāo)準(zhǔn)化推廣。

本研究擬采用麝香類同位素標(biāo)樣稀釋，結(jié)合超聲波有機(jī)溶劑萃取和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，在文獻(xiàn)[21]的前處理方法基礎(chǔ)上深入優(yōu)化，充分利用串聯(lián)質(zhì)譜強(qiáng)大的抗基體干擾能力，省去前處理中基體分散固相法凈化步驟，希望建立化妝品中兩類(硝基麝香和多環(huán)麝香)共10種合成麝香同時(shí)檢測的分析方法，并通過對(duì)市售幾類化妝品樣品的檢測論證該方法的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

7890A-7000B氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電子轟擊源(EI)和MassHunter工作站)，VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司產(chǎn)品；KUDOS型超聲儀：科島超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TB-114電子天平，3-30K型高速冷凍離心機(jī)：北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

正己烷、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、丙酮和甲醇：色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

佳樂麝香(Galaxolide, HHCB)、吐納麝香(Tonalide, AHTN)、粉檀麝香(Phantolide, AHMI)、開許梅隴(Cashmeran, DPMI)、特拉斯(Traseolide, ATII)、西藏麝香(musk tibetene, MT)、薩利麝香(Celestolide, ADBI)、二甲苯麝香(Musk xylene, MX)和酮麝香(Musk ketone, MK)等標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于95%)，氘代吐納麝香(d3-AHTN)和氘代二甲苯麝香(d15-MX)(純度大于98%)：德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；葵子麝香(Musk ambrette, MA)：純度大于98%，美國AccuStandard公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)10種合成麝香標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到1.0 g/L合成麝香標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。以同樣的方法分別得到1.0 g/L的兩種氘代內(nèi)標(biāo)(d3-AHTN和d15-MX)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液的配制：用正己烷將10種合成麝香和2種氘代內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別準(zhǔn)確移取1、2、5、10、20、50、100 μL的1.0 mg/L的10種合成麝香混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，各加入50 μL 1.0 mg/L氘代內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用正己烷定容至1.0 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度均為50.0 μg/L，于4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品前處理 稱取約1.00 g樣品于15 mL具塞刻度離心管中，加入50 μL 1.0 mg/L的d3-AHTN和d15-MX氘代混標(biāo)溶液，再加入1.0 mL飽和氯化鈉水溶液和2.0 mL正己烷提取劑，于40 ℃超聲提取20 min，以8 000 r/min離心3 min，取上清液，剩余樣品殘?jiān)谜和?每次2.0 mL)反復(fù)提取2次，合并上清液，氮吹濃縮至1.0 mL，過0.45 μm濾膜，待GC-MS/MS檢測。

1.3.2色譜條件 色譜柱：VF-WAXms 石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度80 ℃，以10 ℃/min升至160 ℃，再以5 ℃/min升至175 ℃，保持5 min，以1 ℃/min 升至178 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持8 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，0.75 min后開閥。

1.3.3質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度230 ℃；質(zhì)譜儀接口溫度250 ℃；離子監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。監(jiān)測離子對(duì)與碰撞能量等信息列于表1。

表1 10種合成麝香和2種氘代內(nèi)標(biāo)的串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Analysis parameters of mass spectrometry for 10 synthetic musks and 2 deuterated internal standard

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇 在樣品前處理過程中，選取與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)一致的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，能夠有效減少提取及凈化過程中的損失對(duì)檢測結(jié)果的影響。在質(zhì)譜檢測中，以穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量校正，能夠消減不同基質(zhì)對(duì)待測物響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)作用，提高定量的準(zhǔn)確性。d3-AHTN和d15-MX的物理及化學(xué)性質(zhì)基本與目標(biāo)分析物一致，且在化妝品中不存在該類化合物，因此適合作為測定化妝品中合成麝香含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。本方法選用d3-AHTN作為6種多環(huán)麝香(DPMI、ADBI、AHMI、HHCB、ATII和AHTN)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，選擇d15-MX作為4種硝基麝香(MX、MA、MT和MK)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.1.2提取溶劑的優(yōu)化 由于乳液、膏霜等化妝品的乳化體系分水包油和油包水兩種類型，其中的待測物有可能被包于化妝品乳化顆粒最內(nèi)層，如果直接采用溶劑提取，樣品分散性不好，會(huì)限制內(nèi)層待測物的提取率，造成提取效率偏低。故本方法先采用1.0 mL飽和氯化鈉水溶液將樣品充分分散，再用有機(jī)溶劑分次提取，以達(dá)到更好的提取目的。另外，飽和氯化鈉水溶液的加入可產(chǎn)生鹽析作用，減少樣品乳化效應(yīng)的產(chǎn)生。

合成麝香極性較小，具有脂溶性，難溶于水，在弱極性或非極性溶劑中有較好的溶解度。根據(jù)相似相溶原理，并考慮到提取溶劑的普適性，選擇了正己烷、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、丙酮和甲醇作為提取溶劑，考察各提取溶劑對(duì)膏霜類化妝品中合成麝香的提取效率。具體操作如下：稱取1.00 g空白膏霜樣品，加入10 μL 1.0 mg/L的10種麝香混合標(biāo)準(zhǔn)工作中間液(即樣品加標(biāo)水平10.0 μg/kg)混勻，再加入提取溶劑和1.0 mL飽和氯化鈉水溶液，后續(xù)操作參照1.3.1節(jié)。每種提取溶劑重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，提取效率以每種合成麝香的6次平均絕對(duì)回收率計(jì)算。結(jié)果表明，甲醇與飽和氯化鈉溶液體系互溶，無法分層；乙腈、丙酮和二氯甲烷存在部分互溶，且都有不同程度的乳化現(xiàn)象；正己烷和乙酸乙酯對(duì)10種合成麝香的提取效率最高，且正己烷提取溶劑的干擾和雜質(zhì)峰較乙酸乙酯的少，因而選擇正己烷作為提取溶劑。使用不同提取溶劑時(shí)，膏霜類化妝品中10種合成麝香的回收率列于表2。

表2 使用不同提取溶劑時(shí)，膏霜類化妝品中10種合成麝香的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of 10 synthetic musks in cream with different extraction solvents (n=6)

2.1.3提取方式的優(yōu)化 綜合考慮提取方式的方便性與快捷性，實(shí)驗(yàn)考察了振蕩提取、渦旋提取和超聲提取3種方式的提取效率，結(jié)果表明，超聲提取方法的提取效率最好。進(jìn)一步考察了不同提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)提取效率的影響。由于膏霜類樣品的粘度較大，因此以膏狀化妝品為加標(biāo)樣品，加入1.0 mL飽和氯化鈉水溶液和2.0 mL正己烷，渦旋混勻后，經(jīng)超聲提取，結(jié)果示于圖1。在10～40 ℃區(qū)間，合成麝香的回收率隨著超聲溫度的上升而不斷提高，但溫度超出40 ℃后，合成麝香的回收率反而呈現(xiàn)輕微下降，這與DPMI、ADBI等幾種低沸點(diǎn)易揮發(fā)的麝香化合物有關(guān)，溫度越高越易造成該類物質(zhì)的損失。由圖1b可見，回收率在前20 min內(nèi)一直呈上升趨勢，20 min后趨于平緩，且在20～40 min內(nèi)合成麝香的回收率沒有顯著性差異。因此，在40 ℃下超聲提取20 min，對(duì)化妝品樣品中10種合成麝香的提取效率最高。(注：由于篇幅所限，圖1只給出了所有合成麝香待測物的平均回收率趨勢，若需10 種物質(zhì)的詳細(xì)曲線和數(shù)據(jù)，請(qǐng)聯(lián)系作者)

圖1 超聲溫度(a)和超聲時(shí)間(b)對(duì)回收率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic temperatures (a) and ultrasonic times (b) on recoveries

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇 通過參考相關(guān)文獻(xiàn)，并考慮方法的普及性，本實(shí)驗(yàn)首先選用了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀最常用的非極性毛細(xì)管色譜柱DB-5MS(或同類型填料柱)?；衔镌贒B-5MS色譜柱上基本按照其沸點(diǎn)由低到高的順序出峰，因?yàn)镠HCB、ATII、AHTN和MX的沸點(diǎn)差異不大，所以它們?cè)谠撋V柱上的保留時(shí)間很接近，通過優(yōu)化程序升溫條件仍然無法實(shí)現(xiàn)完全分離。實(shí)驗(yàn)選擇了同樣規(guī)格但不同填料的DB-1701、VF-WAXms和HP-FFAP三種色譜柱，希望利用化合物極性的差異，通過改變毛細(xì)管柱填料極性實(shí)現(xiàn)化合物的分離。結(jié)果表明，VF-WAXms和HP-FFAP的分離效果較好，各物質(zhì)均能實(shí)現(xiàn)完全分離，但是由于HP-FFAP是非質(zhì)譜柱，在高溫下使用時(shí)會(huì)有較大的柱流失，易造成質(zhì)譜污染。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇VF-WAXms色譜柱。在MRM掃描模式下，10種合成麝香和2種氘代內(nèi)標(biāo)在VF-WAXms柱上的色譜圖示于圖2。圖中6、7號(hào)峰是d3-AHTN和AHTN的重疊峰，雖然二者存在共流出，無法完全分開，但在定性定量時(shí)可通過提取離子對(duì)進(jìn)行選擇性地分離，不影響測定結(jié)果。另外，圖中的4號(hào)峰有2個(gè)基本分離的峰，這是HHCB的2個(gè)同分異構(gòu)體，在定量計(jì)算時(shí)將這2個(gè)異構(gòu)體峰作加和處理。

注：1.DPMI；2.ADBI；3.AHMI；4.HHCB；5.ATII；6,7.d3-AHTN，AHTN；8.d15-MX；9.MX；10.MA；11.MT；12.MK圖2 10種合成麝香(5.0 μg/L)和2種氘代內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 10 synthetic musks (5.0 μg/L) and 2 deuterium-labeled isotope internal standards

2.2.2三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件的建立 由于合成麝香的電負(fù)性較弱，因此選擇EI質(zhì)譜電離模式，以MRM 模式掃描?；贕C-MS/MS 中母離子和子離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過設(shè)定6個(gè)時(shí)間段和多個(gè)掃描通道同時(shí)檢測10種合成麝香和2種氘代內(nèi)標(biāo)。

首先，通過氣相色譜和單極全掃描確定化合物的保留時(shí)間和一級(jí)碎片離子，選擇響應(yīng)值較好的一級(jí)碎片離子作為母離子。然后選擇合適的碰撞電壓，使合成麝香母離子與碰撞氣體(N2) 進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，進(jìn)一步裂解產(chǎn)生合成麝香碎片子離子，通過質(zhì)量分析器掃描分析得到合成麝香的二級(jí)質(zhì)譜圖。分別選取豐度較強(qiáng)的主要碎片離子作為定量子離子，豐度次強(qiáng)的主要碎片離子作為輔助定性子離子。通過優(yōu)化碰撞能量使目標(biāo)合成麝香的基峰離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度均達(dá)到最大，設(shè)定產(chǎn)生最強(qiáng)子離子響應(yīng)的碰撞電壓為最佳碰撞電壓，具體參數(shù)列于表1。

2.3 檢出限與標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件考察方法的檢出限。稱取1.00 g 樣品，提取定容至1.0 mL，進(jìn)樣量1 μL，以被測物質(zhì)的信噪比S/N≥3時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢出限，以S/N≥10時(shí)的進(jìn)樣濃度為定量限。

采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種多環(huán)麝香(DPMI、ADBI、AHMI、HHCB、ATII和AHTN)以d3-AHTN為內(nèi)標(biāo)，4種硝基麝香(MX、MA、MT和MK)以d15-MX為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。10種合成麝香在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，各化合物的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限列于表3。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

向不含合成麝香的空白膏霜化妝品樣品中分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的10種合成麝香標(biāo)準(zhǔn)樣品，按1.3.1節(jié)前處理方法提取并平行測定6次，計(jì)算10種合成麝香的加標(biāo)回收率及方法精密度。結(jié)果表明，該方法的回收率為92.5%～102.0%，RSD為1.14%～4.50%，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表4。

2.5 實(shí)際樣品分析

利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測市售的100種水、乳液和膏霜類化妝品。結(jié)果表明，在所檢的100批次樣品中，共有43批次檢出合成麝香類物質(zhì)，檢出率較高。其中檢出率最高的是HHCB，達(dá)36%，HHCB在一款保濕面膜中的檢出含量高達(dá)499.9 mg/kg；其次是AHTN，檢出率為27%，其含量范圍為0.1～119.2 mg/kg；在6批次樣品中檢出DPMI，含量范圍為3.2～225.8 mg/kg；在4批次樣品檢出ATII，含量范圍為0.2～24.0 mg/kg。以上被高頻率檢出的均為多環(huán)麝香，目前國內(nèi)還沒有出臺(tái)任何法規(guī)約束其使用范圍或使用量。ADBI、AHMI、MK和MA各有1批次樣品檢出，含量分別為5.6、0.8、5.0和92.1 mg/kg。值得注意的是，MA雖已被全面禁用，但仍然存在不法商家違規(guī)添加的現(xiàn)象。已禁用的MX和MT在所有樣品中均未檢出。

表3 10種合成麝香的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 3 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and limits of quantitation of 10 synthetic musks

表4 10種合成麝香的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 10 synthetic musks (n=6)

3 結(jié)論

目前，化妝品中合成麝香的分析檢測方法尚處于起步階段。本研究建立了GC-MS/MS法快速檢測10種合成麝香，在1.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，10種合成麝香的儀器響應(yīng)值與濃度呈顯著的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；方法定量限達(dá)1.0～8.0 μg/kg。10種合成麝香的加標(biāo)回收率在92.5%～102.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%。該方法簡便、準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可同時(shí)檢測化妝品中10種合成麝香，適合標(biāo)準(zhǔn)化推廣，對(duì)香精香料、日化行業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。