氣相色譜-正化學(xué)電離源-飛行時間質(zhì)譜法測定煙草吸食者唾液中的吡嗪和吡啶類物質(zhì)

司曉喜，張鳳梅，朱瑞芝，劉春波，申欽鵬，尤俊衡，張 濤，繆明明，劉志華

(云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南省煙草化學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650231)

目前，煙草制品的風(fēng)味評價是以人體感官評吸為主，很難排除主觀產(chǎn)生的不確定性。卷煙抽吸過程中，主流煙氣中的多種微量化學(xué)成分被口腔唾液選擇性地溶解、吸收，這些被吸收的成分決定了煙草制品的風(fēng)味[1-3]。研究唾液中溶解、吸收的煙氣成分，能直接、客觀地評價煙草制品的風(fēng)味。

吡嗪和吡啶類化合物是卷煙煙氣中一類重要的風(fēng)味物質(zhì)，具有炒堅果、可可、烤土豆、青椒和肉香等怡人的香味[4-5]。該類化合物沸點較低，易氣化，目前主要采用GC/MS法檢測，且較多使用電子轟擊(EI)電離技術(shù)[5-6]。EI技術(shù)適用范圍廣，但在分析復(fù)雜基質(zhì)成分時，特別是分子質(zhì)量較小的分析物[7]，極易產(chǎn)生干擾?；瘜W(xué)電離(CI)是一種軟電離技術(shù)，碎片離子少、選擇性好，其負(fù)化學(xué)源(NCI)對含電負(fù)性基團的物質(zhì)具有高選擇性和高靈敏度，但容易受分析物電負(fù)性強弱的影響，具有一定局限性[8]；其正化學(xué)源(PCI)在選用甲烷作為反應(yīng)氣時，適用范圍更廣泛，不受分析物電負(fù)性強弱的影響，對不同分析物的靈敏度差異較小[9-10]。將PCI與高分辨飛行時間質(zhì)譜(TOF MS)聯(lián)用可提高痕量分析物鑒定的準(zhǔn)確性[11-12]。目前，國內(nèi)外學(xué)者已將GC-PCI-MS技術(shù)成功應(yīng)用于可卡因及其代謝物[13]、N-亞硝胺[14]、唑類殺菌劑[15]等物質(zhì)的分析檢測，但GC-PCI-TOF MS技術(shù)除了用于測定煙氣中含硫化合物，其他報道較少[16]。

本工作擬建立氣相色譜-正化學(xué)電離源-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-PCI-TOF MS)，并結(jié)合溶劑萃取、分散固相萃取，分析煙草吸食者唾液中的吡嗪和吡啶類物質(zhì)，希望為開發(fā)卷煙產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀GCT Premier：配備正化學(xué)電離源，美國Waters公司產(chǎn)品； 3K30高速冷凍離心機：德國Sigma公司產(chǎn)品；VX-200漩渦混合儀：美國Labnet公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；唾液收集管：德國Salivette公司產(chǎn)品；QuEChERS 2 mL分散固相萃取試劑盒：內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂、50 mgN-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑，美國Agilent公司產(chǎn)品；0.22 μm有機濾膜：天津市津騰實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

二氯甲烷、乙腈：均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；氯化鈉：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；人工唾液：廣東省東莞市科鴻化工有限公司產(chǎn)品；吡啶、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、3-乙基吡啶、三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，德國Dr. Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；市售卷煙樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1唾液樣品的采集 受試者用清水漱口2次后，按5口/支的抽吸速度抽吸1支卷煙。抽吸完成后，將棉棒放入口中，以每秒1次的頻率咀嚼2 min后放入收集管，以5 000 r/min離心15 min后，得到唾液樣品。間隔1 h，按上述步驟重復(fù)抽吸卷煙，并采集唾液樣品。同一受試者共采集3次，合并3次收集的唾液作為供試樣品，于4 ℃冷藏保存。

1.2.2樣品前處理 準(zhǔn)確移取5.0 mL唾液樣品于具蓋離心管中，加入2.5 mL二氯甲烷，于漩渦混合振蕩儀上以2 000 r/min振蕩2 min，然后以5 000 r/min離心5 min，吸取下層液于樣品瓶中。向剩余上層液中再加入2.5 mL二氯甲烷，按上述方法重復(fù)萃取1次，離心后取下層液合并于同一樣品瓶中。將收集到的樣品液于30 ℃下減壓蒸發(fā)至近干，加入0.5 mL乙腈復(fù)溶。復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至2 mL QuEChERS分散固相萃取試劑盒，于漩渦混合振蕩儀上以2 000 r/min振蕩2 min，以5 000 r/min離心5 min，收集上層清液，待測。

1.2.3色譜條件 色譜柱：DB-35 MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流速1 mL/min；進樣量1 μL；不分流進樣1 min；程序升溫：35 ℃保持2 min，以7.5 ℃/min升至125 ℃，再以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

1.2.4質(zhì)譜條件 PCI離子源；電子能量60 eV；離子源溫度180 ℃；發(fā)射電流400 μA；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲4.5 min；CI源反應(yīng)氣為甲烷(純度≥99.999%)，流量56%；質(zhì)量掃描范圍m/z50～400。以全氟三丁基胺為內(nèi)標(biāo)進行調(diào)諧，以m/z413.977 5處作單點鎖定校正分析物碎片的精確質(zhì)量數(shù)。9種分析物的保留時間及特征離子列于表1。

1.3 溶液的配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲備液 分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg各標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制得9種目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)使用液 準(zhǔn)確移取2.0 mL吡啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液，0.4 mL 2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液，0.1 mL 3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，制得9種目標(biāo)分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

表1 9種目標(biāo)分析物的保留時間和特征離子Table 1 Retention times and characteristic ions of nine analytes

1.3.3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別準(zhǔn)確移取0.05、0.25、0.5、1.0和2.5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液于5支10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中，吡啶的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/L；2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的質(zhì)量濃度分別為0.02、0.1、0.2、0.4和1.0 mg/L；3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.025、0.05、0.1和0.25 mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的建立

2.1.1前處理方法的優(yōu)化 使用溶劑萃取法從唾液中萃取分離吡嗪和吡啶類物質(zhì)。由于這兩類物質(zhì)都能溶于大多數(shù)極性及一些非極性溶劑，故選取較常用的二氯甲烷、乙腈作為萃取溶劑進行考察。由于唾液基質(zhì)主要為水，二氯甲烷萃取后分層，乙腈則與唾液相溶。乙腈萃取參照經(jīng)典QuEChERS法進行，通過加入除水劑和鹽進行鹽析萃取。

配制9種目標(biāo)物濃度均為2.0 mg/L的人工唾液作為樣品，以萃取率作為評價指標(biāo)，考察以下3種萃取劑的萃取效果：1) 2.5 mL二氯甲烷；2) 0.5 g 氯化鈉、2.5 mL二氯甲烷；3) 0.5 g氯化鈉、2.5 g無水硫酸鎂、2.5 mL乙腈。同時考察了萃取次數(shù)對萃取效率的影響，結(jié)果示于圖1。

由圖1a可以看出，當(dāng)萃取次數(shù)為1時，以二氯甲烷為萃取劑，9種目標(biāo)物的平均萃取率達(dá)83.6%，加入鹽后目標(biāo)物萃取率降低；以乙腈為萃取劑，對吡嗪類物質(zhì)的萃取效率優(yōu)于二氯甲烷，平均萃取率達(dá)92.9%，但對吡啶類物質(zhì)的萃取率較低，平均萃取率僅為66.4%。由圖1b可以看出，當(dāng)萃取次數(shù)為2時，3種萃取劑對9種目標(biāo)物的平均萃取率均超過95%，以二氯甲烷萃取效果最佳，平均萃取率達(dá)到97.7%，而乙腈對吡啶類物質(zhì)的萃取率僅為71.2%。因此，選取二氯甲烷為萃取劑，萃取次數(shù)為2次。

2.1.2分析方法的建立 由于吡啶和吡嗪類物質(zhì)的質(zhì)量數(shù)均偏低(<200)，在使用EI源電離時，碎片離子響應(yīng)偏低，背景干擾嚴(yán)重。而CI源為軟電離源，其獲得的碎片離子少、背景干擾少、響應(yīng)靈敏度高，而且吡啶和吡嗪類化合物具有弱堿性和親核性，適用于PCI源。

吡啶和吡嗪類物質(zhì)在唾液中含量較低，且前處理后仍有少量干擾物，因此采用較低的初始溫度和較緩慢的升溫程序來實現(xiàn)干擾物與目標(biāo)物分離。選擇不分流進樣，以增加目標(biāo)物的響應(yīng)值。選取響應(yīng)值較高的分子離子(準(zhǔn)分子離子)或碎片離子作為特征離子，9種分析物的特征離子列于表1。優(yōu)化后的電離能為60 eV，在優(yōu)化的條件下，9種分析物均實現(xiàn)良好分離，選擇的特征離子響應(yīng)值高，選擇性好，不受唾液中其他組分的影響，抗基質(zhì)干擾能力強，分析結(jié)果示于圖2。

注：序號所代表化合物同表1；Method 1. 2.5 mL二氯甲烷；Method 2. 0.5 g 氯化鈉、2.5 mL二氯甲烷；Method 3. 0.5 g 氯化鈉、2.5 g無水硫酸鎂、2.5 mL乙腈圖1 不同方法萃取1次(a)與2次(b)時，唾液樣品中吡嗪和吡啶類物質(zhì)的萃取效果Fig.1 Comparison of extraction effect of pyrazines and pyridines in saliva samples by different methods for one time (a) and two times (b)

注：序號所代表化合物同表1圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖(a)和煙草吸食者唾液樣品的總離子流圖、提取離子流圖(b)Fig.2 Total ion chromatogram of standard solution (a) and total ion chromatogram and extraction chromatogram of tobacco smokers’ saliva (b)

2.1.3基質(zhì)效應(yīng) 唾液樣品基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)增強、減弱效應(yīng)均會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在樣品前處理過程中，采取有機溶劑萃取、分散固相萃取對唾液樣品進行凈化以去除基質(zhì)，從而減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。

同時，通過比較空白基質(zhì)、乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)信號強度來評價基質(zhì)效應(yīng)。選取人工唾液作為空白基質(zhì)，按照1.2.2節(jié)方法進行前處理，凈化液蒸干后，加入0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，即得空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液。選取0.05、1.0 mg/L 2個濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行考察，乙腈、空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物響應(yīng)值分別記為R1、R2，基質(zhì)效應(yīng)(ME)=R2/R1，結(jié)果列于表2?？梢钥闯?，9種分析物表現(xiàn)出不同程度的基質(zhì)增強或減弱效應(yīng)，但均在95.8%～108.9%之間，基質(zhì)效應(yīng)并不明顯，可以忽略。

2.2 PCI-TOF MS的定性鑒定

PCI電離作用下，分子離子峰和相應(yīng)的加合離子峰強度高，碎片離子少。當(dāng)選用甲烷作為反應(yīng)氣時，吡嗪和吡啶類物質(zhì)同甲烷離子主要發(fā)生酸堿質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成準(zhǔn)分子離子[M+H]+。另外，樣品離子還會同反應(yīng)氣離子發(fā)生加合反應(yīng)，生成加合離子[M+C2H5]+([M+29]+)和[M+C3H5]+([M+41]+)。2-甲基吡嗪和5-乙基-2-甲基吡啶的PCI-TOF MS質(zhì)譜圖示于圖3，由圖可見，二者響應(yīng)最強的碎片離子均為準(zhǔn)分子離子[M+H]+，此外，二者均有較強的加合離子[M+29]+和[M+41]+。其他7種目標(biāo)物也有類似現(xiàn)象，這有利于定性分析。

表2 基質(zhì)效應(yīng)考察Table 2 Influence of matrix effects

圖3 2-甲基吡嗪(a)和5-乙基-2-甲基吡啶(b)的正化學(xué)電離-飛行時間質(zhì)譜圖Fig.3 PCI-TOF MS spectra of 2-methylpyrazine (a) and 5-ethyl-2-methylpyridine (b)

TOF MS技術(shù)利用特征離子的精確質(zhì)量數(shù)進行分析，質(zhì)量精度可達(dá)10-6級。結(jié)合原子組成的限定條件，可確定碎片離子的元素組成，進而實現(xiàn)目標(biāo)物的定性。選擇響應(yīng)最高的碎片離子作為特征離子，根據(jù)測定的相對分子質(zhì)量推測元素組成，結(jié)果列于表1。9種分析物的特征離子與理論質(zhì)量數(shù)誤差均小于5×10-6，在可接受的誤差范圍內(nèi)。

綜上分析，依據(jù)TOF MS得到吡嗪和吡啶類物質(zhì)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，結(jié)合保留時間、碎片離子與反應(yīng)原理的相符性識別等信息，可實現(xiàn)吡嗪和吡啶類物質(zhì)的定性分析。

2.3 方法驗證

測定了系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以離子的響應(yīng)峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將不含9種分析物的空白唾液樣品按1.2.2節(jié)方法處理后，測定20次，分別以空白響應(yīng)的3倍、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差確定檢出限(LODs)、定量限(LOQs)。

在人工唾液樣品中分別加入低、中、高3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。吡啶的加標(biāo)水平為20.0、100.0和400.0 μg/L；2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的加標(biāo)水平均為4.0、20.0和80.0 μg/L；3-乙基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、5-乙基-2-甲基吡啶、2,3,5,6-四甲基吡嗪的加標(biāo)水平均為1.0、5.0和20.0 μg/L。按優(yōu)化的方法進行6次平行實驗，計算回收率。9種分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率列于表3。結(jié)果表明：9種分析物的相關(guān)系數(shù)R2>0.999 1，定量限為3.0～7.9 μg/L，回收率在85%～104%之間，能夠滿足唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)的分析要求。

表3 唾液樣品中9種分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs, LOQs and recoveries of nine analytes in saliva sample

2.4 實際樣品檢測

選取6種市售卷煙樣品(分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F)進行檢測，按照1.2.1節(jié)方法，每種卷煙采集6名吸食者唾液，分析不同卷煙樣品吸食者唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)。結(jié)果表明：卷煙吸食者唾液中的吡啶類物質(zhì)以吡啶為主，3-乙基吡啶和5-乙基-2-甲基吡啶均未檢出(低于定量限)；卷煙吸食者唾液中的吡嗪類物質(zhì)以2-甲基吡嗪為主，2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪有少量檢出，而2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪只在A樣品吸食者唾液中檢出，平均含量分別為0.81 μg/L和0.73 μg/L。不同卷煙吸食者唾液中檢出的主要吡嗪和吡啶含量以箱圖示于圖4。由圖可見，不同卷煙樣品吸食者唾液中吡啶和2-甲基吡嗪含量存在較大差異。

對以上6種卷煙吸食者唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)含量測定結(jié)果進行主成分分析，結(jié)果示于圖5。從圖可見，同種卷煙不同吸食者唾液中的吡嗪和吡啶類含量能夠較好的聚類，卷煙A、D與其他卷煙差異較大。進一步通過單因素方差和Tukey多重比較檢驗分析，發(fā)現(xiàn)不同卷煙吸食者唾液中檢出的吡嗪和吡啶類含量存在顯著性差異(P<0.05)，這些物質(zhì)可用于區(qū)分不同的卷煙風(fēng)格。

注：a.吡啶;b.2-甲基吡嗪;c.2,5-二甲基吡嗪;d.2,6-二甲基吡嗪;e.2,3-二甲基吡嗪 圖4 不同卷煙樣品吸食者唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)含量箱圖Fig.4 Box plots of pyrazines and pyridines contents in smokers’ saliva of different cigarettes

圖5 6種卷煙樣品吸食者唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)含量的主成分分析Fig.5 Principal component analysis diagram of pyrazines and pyridines content in smokers’ saliva of 6 kinds of cigarettes

3 結(jié)論

建立了氣相色譜-正化學(xué)電離源-飛行時間質(zhì)譜法(GC-PCI-TOF MS)檢測煙草吸食者唾液中9種吡嗪和吡啶類物質(zhì)，結(jié)合特征離子的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、裂解規(guī)律對目標(biāo)物進行定性鑒定，以外標(biāo)法定量。9種目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.9991，定量限為3.0～7.9 μg/L，回收率在85%～104%之間，該方法簡單快速、檢出限低、準(zhǔn)確可靠。將該法用于實際樣品檢測，通過檢測6種市售卷煙樣品，發(fā)現(xiàn)煙草吸食者唾液中主要含有吡啶、2-甲基吡嗪和二甲基吡嗪類物質(zhì)，且不同卷煙樣品其吸食者唾液中的吡啶、2-甲基吡嗪含量存在差異。對不同卷煙樣品吸食者唾液中吡嗪和吡啶類物質(zhì)含量進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)可以根據(jù)吸食者唾液中目標(biāo)物含量將卷煙進行分類。該方法可為評價吡啶和吡嗪類物質(zhì)對煙氣感官質(zhì)量的影響提供科學(xué)依據(jù)。