響應(yīng)曲面法優(yōu)化鉤藤葉中鉤藤堿和異鉤藤堿的提取條件

徐佳瑜，王曉紅，楊勝偉，呂 享，張智仙，張明生

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

鉤 藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.為茜草科Rubiaceae鉤藤屬Uncaria多年生木質(zhì)藤本植物[1]，主要分布于廣東、廣西、四川、江西等地，其性微寒，味甘[2]。鉤藤中含有多種生物堿[3-6]，其中鉤藤堿和異鉤藤堿具有清熱平肝、息風(fēng)定驚、降血壓、抗驚厥等功效[7-9]，近年來受到廣泛關(guān)注。目前對鉤藤的研究主要集中在帶鉤莖枝，在中藥中也常以鉤藤帶鉤的干燥莖枝入藥，葉則棄之不用。然而，已有研究報(bào)道鉤藤葉中也含有鉤藤堿和異鉤藤堿等重要活性成分[10-12]，這說明鉤藤葉亦可作為藥用資源加以利用。為此，本試驗(yàn)以鉤藤葉為試驗(yàn)材料，選擇干燥溫度、超聲提取時(shí)間和提取劑濃度3個因素，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken效應(yīng)面法將各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系進(jìn)行多樣性擬合，通過對回歸方程及響應(yīng)面的分析[13-15]，優(yōu)化鉤藤堿和異鉤藤堿的提取條件，并結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）測定鉤藤堿和異鉤藤堿的含量[16-17]。本研究旨在為鉤藤資源的充分利用提供理論和方法上的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲醇（色譜純，美國TEDIA）；氨水（分析純，成都金山化學(xué)藥品有限公司）；鉤藤堿和異鉤藤堿對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%（中國食品藥品檢定研究院，鉤藤堿批號:11927-201403，異鉤藤批號:112028-261601）；娃哈哈純凈水。

鉤藤Uncaria rhynchophylla (Miq.) Miq. ex Havil.由昌昊金煌（貴州）中藥有限公司提供，經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院熊源新教授鑒定。試驗(yàn)時(shí)，先將鉤藤的葉和鉤莖置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，打粉，過20～40目篩，備用。

1.2 儀 器

Agilent 1260型HPLC儀（Agilent科技有限公司）；電子分析天平（上海菁海儀器有限公司）；JP-040S超聲波清洗機(jī)（深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；UPT-II-20L超純水系統(tǒng)（成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司）；GZX-914MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）等實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

1.3 HPLC測定鉤藤堿和異鉤藤堿含量[17-18]

1.3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:甲醇 -0.1% 氨水（70∶30，V/V）等度洗脫；流速:1.0 mL·min-1；柱溫:30 ℃；檢測波長:245 nm；進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.2 鉤藤葉中鉤藤堿和異鉤藤堿提取液制備

精密稱取鉤藤葉粉末1.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇溶液，混勻后浸泡60 min，稱重，放入4 ℃冰箱過夜，超聲（頻率為40 KHz），甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，靜置，取上清液用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾2次，作為供試品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg和異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品5.25 mg，分別置于25 mL的容量瓶中，加入70%甲醇溶液溶解并定容至刻度線，制成濃度分別為0.20 mg·mL-1鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和0.21 mg·mL-1異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取 0.20 mg·mL-1鉤藤堿和 0.21 mg·mL-1異鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別用70%甲醇定容至刻度線，混勻。按“1.3.1”色譜條件進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU·s）為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制鉤藤堿和異鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 單因素試驗(yàn)

超聲提取法提取鉤藤葉中的鉤藤堿和異鉤藤堿，按照“1.3.2”項(xiàng)的方法制備鉤藤堿和異鉤藤堿的供試液，以“1.3.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行含量測定。試驗(yàn)中，將材料干燥溫度、超聲提取時(shí)間及甲醇濃度作為影響因素，固定其中2個因素，對另一因素進(jìn)行單一因素試驗(yàn)，以提取率為評價(jià)指標(biāo)。

1.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken模型，對試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，考察3個因素對提取效果的影響。

為保障被選派人員自身利益，河北省圖書館承諾被選派人員原有工資、津貼福利待遇標(biāo)準(zhǔn)不變，服務(wù)項(xiàng)目和培養(yǎng)任務(wù)結(jié)束后，對考核合格及優(yōu)秀人員進(jìn)行總結(jié)表彰。選派工作經(jīng)歷視同到艱苦地區(qū)工作經(jīng)歷，符合規(guī)定條件的，在工資、職務(wù)(職稱)晉升、計(jì)算基層工作經(jīng)歷等方面，按現(xiàn)有傾斜政策執(zhí)行。職稱申報(bào)評審、崗位聘用時(shí)，同等條件下優(yōu)先考慮選派人員。

1.6 樣品測定

分別精密稱取同一批次鉤藤葉與鉤莖粉末1.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法制備葉與鉤莖的鉤藤堿與異鉤藤堿的供試液，以“1.3.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行含量測定。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU·s）為縱坐標(biāo)（Y），做回歸方程:鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y1=25.869X+18.754，R2=0.999 8；異鉤藤堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y2=25.486X+32.270，R2=0.999 5。鉤藤堿濃度在2～160 μg·mL-1范圍內(nèi)、異鉤藤堿濃度在2.1～ 168.0 μg·mL-1范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 干燥溫度對提取率的影響

加入70%甲醇、超聲處理60 min，考查材料干燥溫度分別為45、50、55、60、65℃處理時(shí)對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響。結(jié)果鉤藤堿的提取率分別為100.81、118.29、142.25、129.79、114.00 μg·g-1，異鉤藤堿的提取率分別為 346.88、376.60、426.86、403.25、322.53 μg·g-1（ 圖 1）。隨著對鉤藤葉干燥溫度的升高，鉤藤堿和異鉤藤堿的提取率逐漸升高，當(dāng)干燥溫度為55℃時(shí)，鉤藤堿和異鉤藤堿的提取率達(dá)到最高，隨后均逐漸降低?？赡苁怯捎诟邷叵裸^藤堿和異鉤藤堿不穩(wěn)定，使其部分降解，從而導(dǎo)致提取率逐漸降低。

圖1 干燥溫度對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響Fig. 1 Effects of drying temperature on extraction yield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.2.2 提取劑濃度對提取率的影響

在50 ℃下干燥材料、超聲處理60 min，考查甲醇的濃度分別為60%、65%、70%、75%、80%提取時(shí)對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響。結(jié)果鉤藤堿的提取率分別為79.73、81.14、90.25、72.99、49.14 μg·g-1，異鉤藤堿的提取率分別為304.88、294.50、313.41、311.76、283.43 μg·g-1（圖2）。隨著甲醇濃度的增加，鉤藤堿的提取率逐漸升高，異鉤藤堿的提取率先下降后逐漸升高，當(dāng)甲醇濃度為70%時(shí)，此時(shí)鉤藤堿和異鉤藤堿的溶出量達(dá)到最大，鉤藤堿和異鉤藤堿的提取率達(dá)到最高。

圖2 甲醇濃度對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響Fig. 2 Effects of methanol concentration on extractionyield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.2.3 超聲提取時(shí)間對提取率的影響

在50 ℃下干燥材料、加入70%的甲醇，考查超聲處理時(shí)間分別為30、40、50、60、70 min時(shí)對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響。結(jié)果鉤藤堿的提取率分別為 86.33、89.34、102.10、99.04、92.51 μg·g-1，異鉤藤堿的提取率分別為 307.91、304.35、318.04、312.43、298.50 μg·g-1（ 圖 3）。隨著超聲處理時(shí)間的增加，鉤藤堿的提取率逐漸升高，異鉤藤堿的提取率先下降后逐漸升高；當(dāng)超聲處理50 min時(shí)，鉤藤堿和異鉤藤堿的提取率都達(dá)到最高，當(dāng)繼續(xù)超聲提取時(shí)，可能由于儀器長時(shí)間工作產(chǎn)生的熱能使提取溫度緩慢升高，導(dǎo)致鉤藤堿和異鉤藤堿發(fā)生了降解或是異構(gòu)化。

圖3 超聲提取時(shí)間對鉤藤堿和異鉤藤堿提取率的影響Fig. 3 Effects of ultrasound time on extraction yield of rhynchophylline and isorhynchophylline

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken模型，將甲醇濃度（A）、超聲提取時(shí)間（B）和材料干燥溫度（C）作為考查因素，設(shè)置3因素3水平試驗(yàn)，每個水平用代碼-1、0、+1表示，共組合成17組試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test design

運(yùn)用Design-expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到鉤藤堿提取率的二次多項(xiàng)回歸模型為:D1=127.58+2.63A+5.31B-0.73C-1.58AB+0.51AC+2.22BC-1.71A2+0.53B2-12.68C2；異鉤藤堿提取率的二次多項(xiàng)回歸模型為:D2=411.95+8.37A+22.78B+3.89C-7.51AB-1.88AC-12.08BC+3.02A2-5.48B2-51.04C2。

由表3可知，鉤藤堿提取的回歸模型F值=21.27，P值=0.000 3＜0.001，表明二元多次回歸模型極顯著；失擬F值=2.02，失擬項(xiàng)P值=0.253 4＞0.05，模擬失擬不顯著；校準(zhǔn)系數(shù)R2=0.964 7，R2adj=0.919 4＞0.8，CV%=1.9，說明此模型能解釋96.47%的響應(yīng)值變化，該模型擬合程度較好。方差分析表明，模型中一次項(xiàng)超聲時(shí)間（B）極顯著，甲醇濃度（A）顯著，烘干溫度（C）不顯著，影響順序B＞A＞C；二次項(xiàng)C2極顯著，A2、B2不顯著；因素間交互作用均不顯著。試驗(yàn)因素間交互作用的三維空間圖見圖4～圖6。

表3 鉤藤堿回歸方程的方差分析?Table 3 Variance analysis for the created regression model of rhynchophylline

由表4可知，異鉤藤堿提取的回歸模型F值=26.20，P值=0.000 1＜0.001，表明二元多次回歸模型極其顯著；失擬F值=4.86，失擬項(xiàng)P值= 0.080 4＞0.05，模擬失擬不顯著；校準(zhǔn)系數(shù)R2=0.9712，R2adj=0.934 7，CV%=2.19，說明此模型能解釋97.12%的響應(yīng)值變化，該模型擬合程度較好。方差分析表明，模型中一次項(xiàng)超聲時(shí)間（B）極顯著，甲醇濃度（A）顯著，烘干溫度（C）不顯著，影響順序B＞A＞C；二次項(xiàng)C2極顯著，A2、B2不顯著；從交互項(xiàng)作用來看，超聲提取時(shí)間和材料烘干溫度間的交互作用提取效果顯著。試驗(yàn)因素間交互作用的三維空間圖見圖7～圖9。

表4 異鉤藤堿回歸方程的方差分析表Table 4 Analysis of variances for the created regression model of isorhynchophylline

圖4 甲醇濃度和超聲提取時(shí)間交互作用對鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 4 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and ultrasound time to rhynchophylline

圖5 甲醇濃度和干燥溫度交互作用對鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 5 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and drying temperature to rhynchophylline

選取交互作用影響顯著的響應(yīng)面曲面（圖7）進(jìn)行分析，當(dāng)烘干溫度不變時(shí)，異鉤藤堿的提取率隨著超聲時(shí)間的增加而逐漸升高，在超聲時(shí)間在60 min時(shí)達(dá)到最大，說明超聲時(shí)間越長提取率越高；當(dāng)超聲時(shí)間不變時(shí)，隨著干燥溫度的逐漸升高，異鉤藤堿的提取率在55 ℃時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)干燥溫度進(jìn)一步升高，提取率逐漸降低，說明高溫不利于對異鉤藤堿的提取。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)方程擬合出的最佳提取條件為:當(dāng)葉片烘干溫度54.95 ℃時(shí)，甲醇濃度73.35%和超聲時(shí)間60 min，鉤藤堿的理論預(yù)測提取率為 133.34 μg·g-1，異鉤藤堿的理論預(yù)測提取率為429.75 μg·g-1。對理論值進(jìn)行校正，烘干溫度55 ℃，甲醇濃度73%，超聲提取60 min，重復(fù)試驗(yàn)3次，實(shí)際測得鉤藤堿提取率的平均值為130.80 μg·g-1，異鉤藤堿提取率的平均值為425.60 μg·g-1，與理論值較吻合，說明該模型可以較好的優(yōu)化鉤藤葉中鉤藤堿與異鉤藤堿的提取條件。

圖6 超聲提取時(shí)間和干燥溫度交互作用對鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 6 Response surface curve of the interaction between ultrasound time and drying temperature to rhynchophylline

圖7 超聲時(shí)間和烘干溫度交互作用對異鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 7 Response surface curve of the interaction between ultrasound time and drying temperature to isorhynchophylline

2.5 樣品測定結(jié)果

由表5可知，鉤藤葉中異鉤藤堿的含量高于鉤莖中的含量，而鉤莖中鉤藤堿的含量高于葉中的含量。鉤藤常以帶鉤的莖枝入藥，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鉤藤葉中也含有大量的鉤藤堿與異鉤藤堿，所以鉤藤葉具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。

3 討 論

圖8 甲醇濃度和超聲提取時(shí)間交互作用對異鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 8 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and ultrasound time to isorhynchophylline

圖9 甲醇濃度和烘干溫度交互作用對異鉤藤堿提取率影響的響應(yīng)面Fig. 9 Response surface curve of the interaction between methanol concentration and drying temperature to isorhynchophylline

表5 鉤藤葉與鉤莖中鉤藤堿與異鉤藤堿的含量測定Table 5 The content of rhynchophylline and isorhynchophylline in leaves and hooks of U. rhynchophylla

生物堿類化合物是許多中草藥及藥用植物的有效成分[19]，鉤藤葉中生物堿的含量和種類與鉤中相似[10]。在研究中也發(fā)現(xiàn)葉中含有較高的鉤藤堿與異鉤藤堿成分，并且異鉤藤堿含量高于藥用部位鉤莖中的含量。鉤藤作為藥材主要以其帶鉤的莖枝入藥，其余部分則作為廢料被遺棄。由于鉤藤具有良好的降壓作用，人們對其的需求量日益增大，而鉤的資源非常有限，葉資源卻很豐富，每年均可采收，所以將葉棄之不用則造成了很大的資源浪費(fèi)，因此鉤藤葉將是一種值得充分開發(fā)利用的資源[11-12]。

研究表明，鉤藤中吲哚類生物堿不穩(wěn)定，高溫對鉤藤堿和異鉤藤堿的破壞極大[20-23]。本試驗(yàn)對材料干燥溫度做了探究，結(jié)合前期試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)將葉陰干處理后，幾乎很難提出鉤藤堿和異鉤藤堿，而烘干葉時(shí)隨著溫度的升高，鉤藤堿和異鉤藤堿含量都呈先上升后下降的趨勢，在55 ℃時(shí)達(dá)到最大，因此可推測鉤藤堿和異鉤藤堿在55 ℃以下相對穩(wěn)定。

通過響應(yīng)曲面法所得到的模型，鉤藤葉中鉤藤堿和異鉤藤堿的優(yōu)化提取條件為:葉片烘干溫度為54.95 ℃時(shí)，甲醇濃度73.35%和超聲時(shí)間60 min，鉤藤堿和異鉤藤堿能達(dá)到的最高提取率為 133.34 μg·g-1和 429.75 μg·g-1。為了試驗(yàn)的方便性，將葉片烘干溫度修改為55 ℃，提取條件修改為:甲醇濃度73%和超聲提取60 min，藤堿和異鉤藤堿的提取率分別為130.80 μg·g-1和425.60 μg·g-1，與模型的預(yù)測值相接近，說明此方法得到的最佳提取條件是可靠的。