胡椒木釋放揮發(fā)性有機(jī)物成分及變化規(guī)律

蔣冬月，李永紅 ，沈 鑫

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

胡椒木Zanthoxylum piperitum L.，是蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum L.多年生常綠灌木。奇數(shù)羽狀復(fù)葉，葉基有2枚短刺，葉軸有狹翼，小葉對生，葉面濃綠富光澤，具有香氣；生長速度慢，具有耐熱、耐寒、耐旱、耐風(fēng)和耐修剪等特性，因此適于作盆栽、綠籬、地被和修剪造型等，是進(jìn)行平面綠化和垂直綠化的良好材料[1]。胡椒木全株具濃烈的胡椒香味，是一種新興的芳香植物，具有驅(qū)蟲、殺蟲和抗菌等功效[2]，日益受到人們的關(guān)注。近年來，隨著植物揮發(fā)性有機(jī)物提取和檢測技術(shù)的發(fā)展，植物揮發(fā)性有機(jī)物代謝、調(diào)控和機(jī)理的研究取得了較大的進(jìn)展[3-7]，不同植物釋放的揮發(fā)性有機(jī)物成分和變化規(guī)律成為熱門的研究領(lǐng)域之一。目前，對胡椒木的研究主要集中在無性繁殖[8-9]、精油提取技術(shù)[10]和精油化學(xué)成分[11]、抑菌作用[12]、分子生物學(xué)[13]等方面，并未見胡椒木揮發(fā)性有機(jī)物成分及變化規(guī)律的文獻(xiàn)報道。因此，本研究采用頂空-固相微萃取技術(shù)采集不同時期胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測并分析了胡椒木葉片不同季節(jié)和1 d中不同時間釋放的揮發(fā)性有機(jī)物成分及相對含量，揭示其葉片釋放揮發(fā)性有機(jī)物的季節(jié)變化規(guī)律和日變化規(guī)律，為科學(xué)利用胡椒木營造芳香保健型園林景觀提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

胡椒木株齡5 a，種植于深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院西校區(qū)芳香植物園內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物揮發(fā)性有機(jī)物的采集和測定

分別于2012年3、6、9、12月的15日上午8:00—10:00在同一位置的植株上摘取向陽一側(cè)上、中、下部位的健康無損傷的葉片10片，剪碎混勻，稱取0.5 g放置5 mL萃取瓶中密封，靜置30 min，環(huán)境溫度為22±3 ℃。將型號為DVBCAR-PDMS 100 μm的SPME纖維頭通過聚四氟乙烯瓶墊插入到萃取瓶中，置于樣品正上方0.5 cm左右，頂空萃取40 min，然后將纖維頭插入6890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的GC進(jìn)樣口，解吸10 min。每次測定重復(fù)3次，吸附空萃取瓶中的氣體作為空白對照。揮發(fā)性有機(jī)物日動態(tài)變化的測定于6月15日進(jìn)行，8:00—20:00每2 h采樣1次。

色譜條件:HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱色譜柱，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚0.25 μm，載氣為高純氦氣，不分流進(jìn)樣，恒流流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，接口溫度280 ℃。季節(jié)變化測定選擇初始溫度50 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min升至250 ℃，保持8 min。日動態(tài)變化測定選擇初始溫度50 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子阱溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性有機(jī)物成分用氣相色譜-質(zhì)譜-計算機(jī)聯(lián)用儀中MSD Productivity ChemStation進(jìn)行分析鑒定。各組分質(zhì)譜經(jīng)NIST Mass spectral database 2008譜庫檢索，采用保留指數(shù)的方法來輔助質(zhì)譜檢索定性。各成分在樣品氣體中的濃度（相對百分含量）采用峰面積歸一法進(jìn)行計算，計算公式為:濃度=（該成分峰面積/樣品所有氣體峰面積之和）×100%。

通過該公式計算得出的結(jié)果代表了某物質(zhì)在所采集的總氣體樣品中的相對百分含量，并非該成分在大氣中的絕對濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒木葉片揮發(fā)性有機(jī)成分和含量的季節(jié)動態(tài)變化

通過GC—MS分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，從胡椒木葉片1 a中不同季節(jié)釋放的揮發(fā)性有機(jī)物中共鑒定出37種化合物（表1）。其中萜烯類化合物12種、酯類化合物10種、酸類化合物7種、醇類化合物4種，以及少量的烷類和醛類化合物；主要成分為肉桂酸甲酯、β-月桂烯和石竹烯等。3月到12月檢測到胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物種類先減少后增加，其中3月檢測到的揮發(fā)性有機(jī)物種類最多，為24種；9月份最少，為8種（見圖2）。

胡椒木葉片不同季節(jié)釋放的揮發(fā)性有機(jī)物成分的種類和相對含量并不相同。3月份檢測出的揮發(fā)性有機(jī)物種類主要為酯類、萜烯類和酸類物質(zhì)，其中2-十八烯酸單甘油酯相對含量最高，為41.54%，其次為β-松油烯、軟脂酸，2-羥基-1-羥甲基乙酯、硬脂酸，2-羥基-1-羥甲基乙酯和肉桂酸甲酯，其相對含量分別為26.45%、12.71%、5.71%和3.76%。6月份檢測到的種類以酯類和萜烯類為主，醇類物質(zhì)的種類較3月有所增多，而酸類物質(zhì)的種類僅為3月份檢測到的酸類化合物數(shù)量的三分之一；主要含有肉桂酸甲酯、β-月桂烯、1-亞甲-4-(1-甲基-乙烯基)-環(huán)己烷等物質(zhì)。9月和12月份檢測到的揮發(fā)性有機(jī)物種類主要是以萜烯類化合物為主，其中Cyclopentene,3-isopropenyl-5,5-dimethyl-的相對含量最高，達(dá)63%以上，其次為肉桂酸甲酯、β-月桂烯和石竹烯等物質(zhì)。1 a中，每個季節(jié)都檢測到的化合物有辛酸甲酯、肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯。

圖1 胡椒木葉片不同季節(jié)釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的總離子流圖Fig.1 The TIC of VOCs released from leaves of Z. piperitum in different seasons

表1 胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物成分及相對含量的季節(jié)變化?Table 1 The seasonal variations of components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum

續(xù)表1Continuation of table 1

圖2 1 a中不同季節(jié)胡椒木葉片揮發(fā)性有機(jī)物種類的變化Fig. 2 The component numbers of VOCs in different seasons of one-year-old Zanthoxylum piperitum leaves

表2 胡椒木葉片不同季節(jié)揮發(fā)性有機(jī)物成分及含量分類統(tǒng)計?Table 2 The components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum in different seasons

從表2可以看出，1 a中不同季節(jié)，胡椒木葉片釋放的酯類物質(zhì)的相對含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在3月份時含量最高，為64.56%，12月份最低，僅為3月份相對含量的四分之一；萜烯類化合物則呈現(xiàn)先下降后急劇上升的趨勢，在12月份相對含量達(dá)到最高，為84.70%；烷類化合物的相對含量在6月份最高，為63.2%；酸類和醇類化合物僅在3月份和6月份檢測到，且含量較低。胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物主要成分肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯的相對含量都隨季節(jié)呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢。

2.2 胡椒木葉片揮發(fā)性有機(jī)物成分和含量的日變化

在1 d中，胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物種類共鑒定出72種化合物。其中萜烯類化合物21種、烷類物質(zhì)16種、酯類化合物15種、酸類化合物8種、醛類和醇類化合物各4種，以及少量的酮類和其他類化合物；主要成分為肉桂酸甲酯、β-月桂烯、β-松油烯、α-石竹烯等。1 d中不同時段胡椒木葉片揮發(fā)性有機(jī)物的種類呈現(xiàn)先減少后增多再減少的趨勢（圖4）。8:00—10:00揮發(fā)性有機(jī)物種類急劇減少，之后隨著時間的推移不斷增多，在14:00時達(dá)到1 d中最大，然后減少，在16:00之后保持平衡狀態(tài)。

圖3 胡椒木葉片不同時間釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的總離子流圖Fig. 3 The TIC of VOCs released from leaves of Z. piperitum at different times

圖4 1 d中不同時段胡椒木葉片揮發(fā)性有機(jī)物種類的變化Fig. 4 The component numbers of VOCs released from Z. piperitum leaves at different times of a day

在1 d中不同時段，從胡椒木葉片中檢測到的揮發(fā)性有機(jī)物成分的種類和相對含量不相同。8:00檢測出的揮發(fā)性有機(jī)物種類以烷類化合物最多，其相對含量達(dá)到76.38%，其中1,1-二甲基-3-甲基-1,3-丁二炔基環(huán)丙烷含量最高，為69.07%。 其次為萜烯類和酯類化合物，如β-月桂烯、肉桂酸甲酯、α-石竹烯等。10:00和12:00檢測到的揮發(fā)性有機(jī)物種類以萜烯類和酯類化合物為主，萜烯類化合物中β-松油烯和β-月桂烯含量較高，其中β-松油烯的相對含量都在75%以上；酯類化合物以肉桂酸甲酯和乙酸葉醇酯為主。14:00時檢測到的揮發(fā)性有機(jī)物種類以萜烯類最多，其次為酯類、烷類和酸類，并且出現(xiàn)了醛類化合物；但烷類化合物的相對含量最高，其次為酯類、酸類和萜烯類；主要含有1,1-二甲基-3-甲基-1,3-丁二炔基環(huán)丙烷、肉桂酸甲酯、β-月桂烯、油酸和棕櫚酸，相對含量分別為46.34%、15.86%、6.82%、5.84%、5.79%。 16:00、18:00和20:00檢測到得揮發(fā)性有機(jī)物種類和相對含量變化不大，主要集中在萜烯類和酯類化合物。1 d中，每個時間段都檢測到的化合物有肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、(+)-4-蒈烯、石竹烯、α-石竹烯和棕櫚酸。

表3 胡椒木葉片1 d中不同時段揮發(fā)性有機(jī)物成分及含量分類統(tǒng)計?Table 3 The components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum at different times in a day

從表3可以看出，1 d中不同時段，胡椒木葉片釋放的酯類化合物的相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在18:00時達(dá)到最高；萜烯類物質(zhì)呈現(xiàn)先急劇上升后下降再上升又緩慢下降的趨勢，在10:00時最高，14:00時降到最低；烷類物質(zhì)在8:00和14:00含量較高；酸類物質(zhì)在14:00含量最高，而后下降；醛類物質(zhì)從14:00開始出現(xiàn)，呈下降趨勢；酮類和醇類物質(zhì)均在14:00出現(xiàn)最大值。其主要成分的變化趨勢如下:肉桂酸甲酯、石竹烯和α-石竹烯的相對含量呈現(xiàn)低—高—低的變化趨勢，β-月桂烯呈現(xiàn)高—低—高—低的變化趨勢，β-松油烯總體呈現(xiàn)高—低的趨勢。

3 結(jié)論與討論

目前國內(nèi)對胡椒木和花椒屬其他植物揮發(fā)性有機(jī)物的研究多采用水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳萃取法和溶劑提取法[2,14-17]。蒸餾法簡單易行，適于難溶或不溶于水的成分的提??；但其屬于非活體提取，長時間高溫提取會使某些揮發(fā)性物質(zhì)受到破壞；超臨界二氧化碳萃取法適用于親脂性、分子量和極性較小的物質(zhì)的萃取，而對極性大、分子量太大的物質(zhì)較難萃?。蝗軇┨崛》ㄊ歉鶕?jù)相似相溶原理，選擇適合的溶劑非常關(guān)鍵，但溶劑中的微量雜質(zhì)沉淀在提取物中，影響提取物的純度[18]。通過對比各種提取方法，本研究采用了頂空-固相微萃取采集法，此方法所需樣品量少，無需溶劑，操作簡化，集采樣、萃取、濃集、進(jìn)樣于一體，非常適合芳香植物揮發(fā)性成分的研究，已在許多植物揮發(fā)性有機(jī)物的研究中得到應(yīng)用[19-22]。

隨著季節(jié)的變化，胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的種類在3月份最多，有24種，主要為酯類、萜烯類和酸類物質(zhì)；其次是6月份，為20種；9月份最少，為8種。前人對植物揮發(fā)性有機(jī)物釋放規(guī)律的研究表明，揮發(fā)性有機(jī)物釋放的種類和相對含量與采樣時溫度、濕度、氣孔導(dǎo)度、光照以及蒸騰速率等關(guān)系密切[23-27]。3月份光照時間較短，溫度都較低，僅為15.9 ℃，此時植物體內(nèi)合成代謝較慢，生長較慢，因此形成的VOCs種類較少；而隨著夏季的到來，光照時間變長，溫度逐漸升高，達(dá)到30 ℃左右，植物進(jìn)入生長旺盛階段，體內(nèi)有機(jī)物合成、代謝加快，其揮發(fā)性有機(jī)物的種類增多[28-30]。而試驗結(jié)果顯示3月份胡椒木釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的種類最多，這似乎與前人的研究結(jié)果不一致。但是，通過對比3月和6月胡椒木釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的成分發(fā)現(xiàn)，葉片在3月份釋放的酸類物質(zhì)達(dá)7種，而葉片6月份釋放的酸類物質(zhì)僅2種，且3月份釋放的酸類化合物的相對含量僅占總揮發(fā)性有機(jī)物的2.49%，并不是揮發(fā)性有機(jī)物的主要成分。酯類和萜烯類化合物是胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的主要成分，這兩大類物質(zhì)所包含的揮發(fā)性有機(jī)物的種類隨夏季的到來呈現(xiàn)上升趨勢；且其主要揮發(fā)性有機(jī)物肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯等的相對含量均隨季節(jié)呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢；與前人的研究結(jié)果一致。

同樣，1 d中不同時間段外界環(huán)境條件的改變也會影響植物的代謝活動，從而影響植物VOCs的合成和釋放。試驗得出，1 d中，胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的種類呈現(xiàn)先減少后增多再減少的趨勢，在14:00達(dá)到高峰，以萜烯類化合物為主。這類化合物的生成受到光照、溫度和濕度等環(huán)境因子的顯著影響，其中大部分萜烯類化合物釋放的高峰期在13:00左右[25,31]。14:00采樣時溫度為34.3 ℃，空氣濕度達(dá)54.9%，這些外界環(huán)境均有利于萜烯類化合物合成酶的活化；同時，植物自身旺盛的光合作用為萜類化合物合成提供充足的碳源和還原力，強(qiáng)烈的蒸騰作用也為化合物的擴(kuò)散創(chuàng)造了條件[32-33]。植物葉片釋放揮發(fā)性有機(jī)物種類的多少和相對含量的高低與外界環(huán)境以及植物自身條件的密切相關(guān)，每種揮發(fā)性有機(jī)物的釋放量受哪幾種因素的影響尚不明確，這有待后續(xù)進(jìn)一步開展研究。

另一方面，隨著科研人員對植物揮發(fā)性有機(jī)物研究的深入，相關(guān)研究結(jié)果證實了植物的保健功效得益于自身散發(fā)的某些揮發(fā)性成分。例如，針葉樹釋放的萜烯類化合物使人情緒趨于放松狀態(tài)，使人感覺清新、舒爽和愉悅[34-35]；檸檬油、雪松醇、龍腦和1,8-桉葉油能夠降低心率和血壓[36]；本研究檢測到胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物的主要成分為肉桂酸甲酯、β-月桂烯、β-松油烯、石竹烯等；其中，肉桂酸甲酯具有果香氣味，可用于香料和化妝品的制造[37]；β-月桂烯具有降血糖、防癌的功效[38]；石竹烯具有一定的抗菌和消炎作用[39]，同時可用來治療抑郁及焦慮[40]等。這說明胡椒木葉片釋放的揮發(fā)性有機(jī)物可以起到抑菌及調(diào)節(jié)人體情緒的作用，是營造保健型彩色園林景觀的理想樹種。