全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)體外細(xì)胞毒性及肌肉植入試驗(yàn)

黃學(xué)良 朱雙芳 林雨聰 周初松

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院（廣州 510282）

胸腰椎后路減壓內(nèi)固定術(shù)是治療脊柱疾病常見(jiàn)的手術(shù)方式，可實(shí)現(xiàn)脊柱的360°環(huán)形減壓、前方支撐、重建脊柱穩(wěn)定性，也是脊柱外科醫(yī)師最為熟悉的手術(shù)入路［1］。但對(duì)于嚴(yán)重的胸腰椎爆裂性骨折、椎體腫瘤等疾病，胸腰椎前路手術(shù)具有暴露充分、減壓徹底、固定牢固等優(yōu)勢(shì)［2］。目前臨床上常用的前路內(nèi)固定系統(tǒng)有很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)。作者自主研發(fā)的全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)（圖1）由鈦合金和表面羥基磷灰石涂層制成，具有全內(nèi)置、可膨脹性等特點(diǎn)，在前期研究中已證明其具有良好的生物力學(xué)性能，可重建脊柱穩(wěn)定性。本研究根據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［3］，采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)和肌肉植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)此內(nèi)固定系統(tǒng)在這兩方面的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8周齡SD大鼠12只，雌雄不限，體質(zhì)量180～200 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要材料、儀器及浸提液的制備 全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定螺釘（由北京富樂(lè)公司生產(chǎn)，并由北京航空航天大學(xué)進(jìn)行螺釘表面羥基磷灰石涂層）；L929小鼠成纖維細(xì)胞、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、5%DMSO（二甲基亞砜）、MTT溶液；倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。浸提液的制備：以含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，浸提比為0.2 g/mL，在（37±1）℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱浸提（72±2）h獲取浸提液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組（內(nèi)固定材料在浸提液濃度為100%、75%、50%、25%時(shí)分別配制）；空白對(duì)照組（浸提介質(zhì)）；陰性對(duì)照（密度聚乙烯）；陽(yáng)性對(duì)照（5%DMSO）。將培養(yǎng)48～72 h的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)液稀釋成密度為（2.5×104）個(gè)/mL懸液，分為7組，將細(xì)胞懸液接種至3塊96孔板中，每組每塊板各6孔，每孔100 μL，將其放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去各96孔板中的原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗2遍，加入相應(yīng)的浸提液100 μL，于第3、5天更換1次浸提液。3塊96孔板分別培養(yǎng)1、3、5天后，棄去原培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO后，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，計(jì)算相對(duì)增殖率（RGR）。RGR=（吸光度平均值/空白對(duì)照組吸光度平均值）×100%。細(xì)胞毒性分級(jí)如表1。

圖1 全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)的外觀照Fig.1 Appearance of the built?in expandable bio?coating anterior spinal fixation system

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)Tab.1 Cytotoxicity grades

1.3.2 肌肉植入試驗(yàn) SD大鼠12只，用3%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉后，俯臥固定，背部備皮、消毒。切開大鼠背部正中皮膚，鈍性分離肌肉，在大鼠脊柱兩側(cè)約1 cm處各分離成1個(gè)肌腔隙，將1個(gè)被測(cè)內(nèi)固定材料（高8 mm，直徑3 mm圓柱體）植入右側(cè)，左側(cè)切開但不植入，作為空白對(duì)照組，生理鹽水沖洗切口并逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素，觀察大鼠活動(dòng)及切口情況。分別于術(shù)后1、4、12、26周取材，每組3只。原切口切開，先行大體觀察，再取包含材料的肌肉組織及對(duì)側(cè)肌肉組織行切片固定，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（HE染色），在光學(xué)顯微鏡下觀察組織反應(yīng)情況。按照GB/T16886.6?1997中的組織反應(yīng)分級(jí)方法分級(jí)。見(jiàn)表2。

評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（陰性對(duì)照樣品應(yīng)符合此標(biāo)準(zhǔn)）：植入7 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度≤Ⅳ級(jí)，囊壁形成0級(jí)；植入15 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度≤Ⅲ級(jí)，囊壁形成Ⅳ級(jí)；植入30 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度≤Ⅱ級(jí)，囊壁形成Ⅱ級(jí)；植入60 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度≤Ⅰ級(jí)，囊壁形成Ⅱ級(jí)；植入90 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度≤Ⅰ級(jí)，囊壁形成Ⅰ級(jí)；植入180、360 d：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度I級(jí)，囊壁形成Ⅰ級(jí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn) 光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及各材料浸提液組的細(xì)胞形態(tài)正常，以長(zhǎng)梭形或多角形為主，貼壁生長(zhǎng)良好。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)多呈圓形，明顯可見(jiàn)細(xì)胞溶解，貼壁生長(zhǎng)差。根據(jù)各組RCG值，各材料浸提液細(xì)胞毒性分級(jí)為0～1級(jí)之間，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，各材料浸提液組在1、3、5 d的RCG值兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各材料浸提液組在各個(gè)時(shí)間段的RCG值與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而各材料浸提液組、空白對(duì)照組以及陰性對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間段的RCG值與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖2。

表2 組織反應(yīng)分級(jí)Tab.2 Tissue reaction grades

表3 各組RCG和細(xì)胞毒性分級(jí)Tab.3 RCG and cytotoxic grades of each group

2.2 肌肉植入試驗(yàn) 12只SD大鼠均正常存活至試驗(yàn)結(jié)束，切口一期愈合。術(shù)后1周，切口腫脹消退，材料與周圍組織結(jié)合不緊密，未見(jiàn)炎性滲出或壞死組織，鏡下觀察可見(jiàn)材料周圍組織有以中性粒細(xì)為主的炎癥反應(yīng)，無(wú)纖維囊形成，炎癥細(xì)胞反應(yīng)Ⅳ級(jí)，囊壁形成0級(jí)，對(duì)側(cè)空白對(duì)照組肌肉切開部分與周圍組織無(wú)明顯差異，鏡下亦可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。術(shù)后4周，材料與周圍組織結(jié)合稍緊密，鏡下見(jiàn)炎性細(xì)胞明顯減少，有成纖維細(xì)胞增殖，形成厚薄不一的纖維囊腔，炎癥細(xì)胞反應(yīng)Ⅱ級(jí)，囊壁形成Ⅱ級(jí)。術(shù)后12周，材料與周圍組織結(jié)合緊密，鏡下未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞，材料周圍形成完整較均一的纖維囊腔，炎癥細(xì)胞反應(yīng)Ⅰ級(jí)，囊壁形成Ⅰ級(jí)。術(shù)后26周，肌肉組織完全包裹植入材料，鏡下未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，纖維囊腔完整，炎癥細(xì)胞反應(yīng)Ⅰ級(jí)，囊壁形成Ⅰ級(jí)。術(shù)后4、12、26周空白對(duì)照組肌肉組織與周圍組織無(wú)明顯差異，鏡下無(wú)明顯炎性反應(yīng)或囊腔形成（表4、圖3）。

圖2 各組細(xì)胞在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的光鏡下觀察結(jié)果Fig.2 The results of each groups in cell toxicity test

表4 各組組織反應(yīng)分級(jí)Tab.4 Tissue reaction grades of each group

圖3 被測(cè)材料植入大鼠肌肉后局部反應(yīng)試驗(yàn)的光鏡下觀察結(jié)果（HE染色×100）Fig.3 The results of the local reaction test of rat muscle implantation（HE staining × 100）

3 討論

全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)由可膨脹的釘體、內(nèi)芯、連接棒和螺帽組成，通過(guò)內(nèi)芯的擰入，可實(shí)現(xiàn)釘體的膨脹［4］。在植入過(guò)程中，將螺釘及連接棒完全植入椎體及椎間隙中，實(shí)現(xiàn)該內(nèi)固定系統(tǒng)的全內(nèi)置，減少了釘棒對(duì)周圍臟器、血管等組織的干擾。前期研究中，通過(guò)與Kaneda系統(tǒng)、Z?Plate系統(tǒng)的比較，發(fā)現(xiàn)三組內(nèi)固定系統(tǒng)都可重建胸腰椎的即刻穩(wěn)定性，具有良好的生物力學(xué)性能［5］。全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)由鈦合金基體及表面羥基磷灰石涂層組成，其中鈦合金為鈦鋁合金。鋁元素是人體的一種微量元素，如果體內(nèi)殘留過(guò)量的鋁可引起阿爾茲海默病、骨軟化癥等疾?。?-7］。羥基磷灰石的化學(xué)成分與人體骨骼和牙齒中的礦物質(zhì)組成相似度極高，是脊椎動(dòng)物骨組織和牙齒重要的無(wú)機(jī)組成部分。羥基磷灰石在植入生物體后可與骨細(xì)胞在短期內(nèi)形成化學(xué)鍵合，且具有誘導(dǎo)骨細(xì)胞長(zhǎng)入涂層間隙的特點(diǎn)。另外，羥基磷灰石涂層還可抑制鈦合金釋放金屬離子，是一種具有優(yōu)良生物活性的醫(yī)用材料［8-9］。然而，由于其機(jī)械強(qiáng)度不高、脆性大等特點(diǎn)限制了其在人體承重部位的應(yīng)用［10］。本研究中的全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)由鈦合金和羥基磷灰石涂層組成，二者取長(zhǎng)補(bǔ)短，既可發(fā)揮鈦合金良好的機(jī)械性能的優(yōu)勢(shì)，又可發(fā)揮羥基磷灰石良好生物相容性的特點(diǎn)，有效提高了植入物的綜合性能，且對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞不具有毒性作用［7］。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該內(nèi)固定系統(tǒng)的生物相容性，本研究根據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)該內(nèi)固定系統(tǒng)在細(xì)胞毒性和肌肉植入后局部反應(yīng)方面的安全性。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是通過(guò)模擬細(xì)胞生存的環(huán)境，觀察材料浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及增殖的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)材料生物相容性的一種有效而快速的方法［11-12］。L929小鼠成纖維細(xì)胞具有增殖能力強(qiáng)、傳代穩(wěn)定、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境敏感等特點(diǎn)，被美國(guó)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦為體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞［13］。試驗(yàn)采用MTT比色法的原理在于MTT被活細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶還原成藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶并沉積，DMSO可將其溶解成溶液，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，甲臜結(jié)晶數(shù)量與存活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可通過(guò)吸光度值反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況［14-15］。本研究中，通過(guò)觀察第1、3、5天各組細(xì)胞的形態(tài)和測(cè)定其吸光度值可發(fā)現(xiàn)，25%、50%、75%、100%四組不同濃度材料浸提液細(xì)胞形態(tài)正常，增殖良好，吸光度值在93.74%～103.38%之間，細(xì)胞毒性分級(jí)為0～1級(jí)，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異。而在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)大多呈圓形，貼壁生長(zhǎng)較少，可見(jiàn)明顯細(xì)胞溶解現(xiàn)象，其吸光度值在35.67%～48.47%之間，細(xì)胞毒性分級(jí)為3級(jí)。因此本研究中被測(cè)材料無(wú)細(xì)胞毒性。

植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)是將被測(cè)材料植入到活體動(dòng)物某一部位組織內(nèi)，通過(guò)在肉眼和顯微鏡觀察水平上評(píng)價(jià)材料植入后周圍組織局部反應(yīng)的試驗(yàn)方法。本試驗(yàn)將被測(cè)的內(nèi)固定材料植入大鼠背部脊柱旁一側(cè)肌肉腔隙中，以對(duì)側(cè)肌肉為空白組，通過(guò)植入術(shù)后1、4、12、26周術(shù)區(qū)肌肉的大體觀察和顯微鏡下觀察來(lái)評(píng)價(jià)被測(cè)材料的植入后局部反應(yīng)。由試驗(yàn)結(jié)果我們可知，植入術(shù)后試驗(yàn)大鼠一般情況良好，未發(fā)生死亡、術(shù)區(qū)感染等不良并發(fā)癥。術(shù)后1周，被測(cè)材料及空白對(duì)照周圍肌肉組織可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，考慮由材料局部刺激和術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)引起。術(shù)后4、12、26周植入材料周圍炎性細(xì)胞逐漸消失，且逐漸形成穩(wěn)定的纖維包裹，而空白對(duì)照組肌肉組織與其周圍肌肉組織在大體上和顯微鏡下觀察未見(jiàn)明顯異常。說(shuō)明被測(cè)材料隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)，與周圍肌肉組織趨于穩(wěn)定狀態(tài)。未發(fā)生壞死或炎癥反應(yīng)，提示被測(cè)材料對(duì)周圍肌肉組織無(wú)毒性，植入后局部反應(yīng)良好。

綜上所述，全內(nèi)置式可膨脹型生物涂層脊柱前路內(nèi)固定系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞毒性，植入后對(duì)周圍肌肉組織無(wú)刺激反應(yīng)。該內(nèi)固定材料符合作為植入性的醫(yī)用生物材料在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。