大曲曲藥中脲酶功能菌的選育與應(yīng)用

徐占成，徐姿靜，唐清蘭，劉孟華

（四川劍南春集團有限責任公司，四川綿竹618200）

脲酶（Urease，urea amidohydrolase，EC 3.5.），又稱尿素氨基水解酶，存在于大多數(shù)細菌、曲霉和高等植物中。它是一種酰胺酶、能使有機物質(zhì)分子中酶鍵水解。其作用專一性僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和碳酸。有部分微生物產(chǎn)生的酸性脲酶(acid urease)不同于植物中提取的中性、偏堿性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性環(huán)境，在pH4.0～5.5的體系中仍具有活性[1]。

在國外，乳酸桿菌已經(jīng)被用于生產(chǎn)脲酶制劑，有效減少了葡萄酒中尿素含量[2-6]。在國內(nèi)，脲酶已經(jīng)被用于降低黃酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我國尚未形成生產(chǎn)能力，目前所用的酶制劑均從國外進口[7]。例如，某公司購買日本生產(chǎn)的酒用酸性脲酶去除黃酒中的尿素，該酸性脲酶在紹興黃酒中作用時間48 h左右，可有效除去黃酒中約80%的尿素[8]。

由于酒用酸性脲酶被作為食品添加劑直接添加到葡萄酒或者黃酒中，而報道的產(chǎn)脲酶菌株都是細菌，普遍從動物糞便（鳥糞、鼠糞、牛羊糞便）、農(nóng)田土壤、污泥等中分離獲得[9]，并且需要一系列復(fù)雜的酶純化提取工藝才能獲得高純度的酶制劑，從而極大地增加了生產(chǎn)成本，也增加了大規(guī)模生產(chǎn)的難度。

隨著國內(nèi)對酸性酒用脲酶的需求量不斷增加，迫切需要解決酒用脲酶在國內(nèi)生產(chǎn)能力不足的現(xiàn)狀，因此酒用脲酶的研究對我國釀酒業(yè)的發(fā)展，拓展國際市場等方面均有深遠的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：劍南春中溫大曲曲藥。

分離平板培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖18，氯化鈉5，磷酸二氫鉀2，瓊脂20，尿素20，0.4%酚酞溶液3 mL，調(diào)pH7.0后分裝于三角瓶，121℃滅菌20 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽汁，取大麥芽粉碎，加入4倍于麥芽質(zhì)量的55～60℃的水，在55～60℃下保溫3～4 h，過濾，煮沸，再次過濾，將麥芽汁濃度調(diào)整到5～70°Bx，分裝200 mL/500 mL，115 ℃滅菌20 min備用。

儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計cary50，美國瓦里安公司；酸度計Biorad C1000 PCR儀，美國Biorad公司；Wide mini sub電泳儀，美國Biorad公司；Biorad凝膠成像系統(tǒng)，美國Biorad公司；Biolog全自動微生物鑒定儀，美國Biolog公司；Thermo fisher高速冷凍離心機；美國Thermo fisher scientific公司；Minfors INFORS HT-5L發(fā)酵罐，瑞士INFORS公司；Biospec Minnibeadbeater細胞破碎儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 脲酶酶活性測定

將干燥的菌絲磨成粉狀，參照邱業(yè)先等[10-11]的方法測定脲酶活性，取0.1 g菌絲，置于100 mL容量瓶中，加2 mL甲苯處理15 min，分別加入10%尿素10 mL和20 mL pH6.7檸檬酸鹽緩沖液,混合均勻。將容量瓶置于37℃下培養(yǎng)24 h，用38℃蒸餾水稀釋至刻度，振蕩并過濾。取濾液0.5 mL，加入4 mL苯酚鈉（1.35 mol/L）溶液，并加入3 mL次氯酸鈉（0.9%）溶液，仔細混勻顯色20 min，最后用蒸餾水定容至50 mL。用Varian Cary 50 BiO型分光光度計，在578 nm處測光吸收值。根據(jù)標準曲線求出氨態(tài)氮含量。零空白不加入樣品，其他操作與樣品實驗相同。對每一樣品設(shè)置用水代替基質(zhì)的對照。

酶活性定義：30℃，pH7.0條件下，1 g酶制劑1 min分解尿素產(chǎn)生氨的毫克數(shù)表示酶的活性U。

1.2.2 產(chǎn)脲酶菌株的分離、純化

無菌條件下取10 g酒曲于裝有90 mL無菌水并放有玻珠的250 mL三角瓶中，置揺床上室溫振蕩30 min。取菌液按10倍的梯度稀釋到10-6，取各稀釋度菌液1 mL放入無菌平皿中，倒入滅菌后冷卻至50℃的培養(yǎng)基，混勻，待凝固后放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，按菌落周圍是否變紅進行初篩。

1.2.3 高產(chǎn)脲酶菌種的篩選

保存菌株接種到ME培養(yǎng)基上活化，30℃光照培養(yǎng)10 d，待其產(chǎn)孢子后，用無菌水洗下孢子，配制成濃度約為106個/mL的孢子懸液。然后將孢子懸液按照每瓶2 mL的接種量接種到脲酶發(fā)酵培養(yǎng)基中（200 mL/500 mL三角瓶）。在35℃條件下，180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)6 d。收集菌絲及液體，測定其脲酶活性。按其脲酶活力大小及菌株性能，篩選出高產(chǎn)脲酶的菌株。

1.2.4 菌種形態(tài)及生理生化鑒定

菌落形態(tài)觀察，顯微結(jié)構(gòu)觀察及生理生化指標的測定。

1.2.5 18S rDNA分子生物學法鑒定菌種

（1）DNA提取

收集菌體，溶于5 mL提取緩沖液（100 mM Tris·Cl，100 mM EDTA-2Na，200 mM NaCl，2%CTAB，pH8.0）中，37 ℃振蕩45 min。加入0.75 mL 20%SDS，65 ℃水浴1 h。12000 r/min，離心10 min，收集上清液。上清液用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶4∶1）抽提 2次，加入終濃度 0.3 M 的 NaAC（pH5.2）及2倍體積的無水乙醇，室溫沉淀1 h。4 ℃，12000 r/min，離心20 min，收集沉淀，用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50 μL TE（10 mm Tris-HCl，1 mm EDTA-2Na，）中，即得總DNA。

（2）擴增18S rDNA

以總DNA為模板，真菌通用引物18SF（SEQ ID No.2：CCAACCTGGTTGA TCCTGCCAGTA）和18SR（SEQ ID No.3：CCTTGTTACGACTTCACCTT CCTCT）分別為正向引物和反向引物擴增18S rDNA。擴增反應(yīng)體系為 50 μL：10×Buffer 5 μL，dNTP 1 μL，Taq 酶 0.5 μL（2 U），正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 40.5 μL。擴增反應(yīng)條件：94 ℃、4 min預(yù)變性；94℃、0.5 min，55 ℃、1 min，72℃、0.5 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。

表1 初篩得到菌株的變紅時間及顏色深淺

（3）18S rDNA序列分析

將擴增的18S rDNA片段送上海生工測序，通過美國國家生物技術(shù)信息中心的BLAST搜索程序進行比較，獲得同源性比對分析結(jié)果。

1.2.6 脲酶制劑的制備

利用發(fā)酵罐生產(chǎn)脲酶制劑，選用發(fā)酵培養(yǎng)基對脲酶菌株進行發(fā)酵，發(fā)酵6 d后，收集菌絲體，用無菌水多次洗滌，然后低溫冷凍干燥，4℃冷藏保存?zhèn)溆?。干燥后的菌絲采用細胞破碎儀破碎與粉碎機粉碎后，測定脲酶活性，試驗重復(fù)3次。

1.2.7 脲酶制劑在釀酒過程中的應(yīng)用

（1）不同pH值對脲酶活性的影響

釀酒發(fā)酵過程中的pH值一般維持在3.5～4.5之間，因此研究pH值對其酶活性的影響對進一步的應(yīng)用研究有指導(dǎo)意義。用乳酸和乳酸鈉緩沖液調(diào)整不同pH值，用不同pH值乳酸和乳酸鈉緩沖液代替檸檬酸緩沖液，測定脲酶制劑在不同pH值條件下的脲酶活性。

（2）脲酶制劑在釀酒中的應(yīng)用

為了進一步研究酸性脲酶在釀酒中的應(yīng)用，本研究購買市售黃酒實施了尿素去除率實驗。將制成的脲酶制劑按照一定量加入上述酒樣中，置于25℃條件下反應(yīng)，每隔24 h測定尿素的含量[12]。

將JNC-U5菌株應(yīng)用于中溫大曲曲藥生產(chǎn)，提高大曲的脲酶活性。將大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，去除生成EC的底物，確保白酒的食品安全性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)脲酶菌株的篩選

因為脲酶分解尿素產(chǎn)生氨使培養(yǎng)基呈堿性；酚酞遇堿變紅，顏色的深淺初步表示了菌株產(chǎn)脲酶能力的大小，初篩結(jié)果見表1。

挑選菌落周圍變紅的22株單菌落保存，初篩得到的菌株經(jīng)形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)主要為霉菌和細菌。

將初篩的菌株進行復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性研究。經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接后發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)菌株產(chǎn)脲酶的能力逐漸喪失，結(jié)果見圖1。經(jīng)過多代篩選，最終選出1株產(chǎn)脲酶能力穩(wěn)定的菌株JNC-U5，其產(chǎn)脲酶活力可達49.7 U/g，根據(jù)形態(tài)初步鑒定為霉菌。

圖1 22株菌株的脲酶活性

2.2 形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

將4℃保存的菌株用ME斜面培養(yǎng)基活化3 d，然后用接種針挑取斜面的菌落接種到ME平板培養(yǎng)基上，以28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)，于顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)，用掃描電鏡Quanta TM450FEG觀察菌體的超微結(jié)構(gòu)（圖2）。

該曲霉菌落在ME培養(yǎng)基上呈輻射生長，有輻射形溝紋，28℃培養(yǎng)7 d，直徑22～30 mm；顏色呈灰綠色，周圍有白色的暈圈；菌落反面呈淡褐或暗褐色。分生孢子梗直接生于基質(zhì)或生于氣生菌絲，分生孢子為球形或近球形，孢子表面粗糙，有小刺；小分生孢子頭呈疏松柱形或散亂。

圖2 菌落形態(tài)及菌體超微結(jié)構(gòu)

表2 JNC-U5菌株生理生化特征結(jié)果

生理生化鑒定采用Biolog微生物鑒定儀進行鑒定。將曲霉的孢子懸液接種到微生物鑒定板中，該鑒定板中含有各種碳、氮源及微量成分，以鑒定板的第一個小孔作為空白對照。在28℃條件下，培養(yǎng)48 h，然后用Biolog微生物鑒定儀，750 nm處測吸光值，得出的生理生化鑒定結(jié)果見表2。

生理生化鑒定結(jié)果與Biolog系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示，篩選得到的產(chǎn)脲酶菌株JNC-U5為聚多曲霉。同時形態(tài)特征也與聚多曲霉形態(tài)特征相符。

2.3 18S rDNA分子生物學鑒定結(jié)果

以真菌18SF、18SR作為引物擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠鑒定，在1800～1900 bp之間，目的條帶清晰（圖3），引物特異性強，與預(yù)期結(jié)果一致。將PCR產(chǎn)物送上海生工測序，測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心的BLAST搜索程序進行比較獲得同源性分析結(jié)果（見表3）。

圖3 JNC-U5 18S rDNA擴增產(chǎn)物電泳圖

同源性分析結(jié)果表明，JNC-U5 18S rDNA基因序列與數(shù)據(jù)庫中聚多曲霉(Aspergillus sydowii)基因序列覆蓋度達99%，同源性達99%，因此認定JNC-U5菌株為聚多曲霉。

2.4 脲酶制劑的制備

JNC-U5脲酶產(chǎn)生菌株經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化后，經(jīng)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵收集菌絲。菌絲低溫冷凍干燥后采用細胞破碎儀破碎與粉碎機粉碎，其脲酶活性結(jié)果見表3。

表3 不同制備方法脲酶活性

兩種不同的處理方式酶活基本相同（表3），但采用粉碎機粉碎操作簡單，所以該脲酶制劑的制備選用粉碎機直接粉碎即可用于生產(chǎn)，極大地降低了生產(chǎn)成本，更適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。該脲酶制備方法已獲得國家發(fā)明專利，專利號：ZL201210531870.2。

2.5 脲酶制劑在釀酒過程中的應(yīng)用

2.5.1 不同pH值對脲酶活性的影響

釀酒發(fā)酵過程中的pH值一般維持在3.5～4.5之間，因此本文研究了pH值對脲酶活性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同pH值對脲酶活性的影響

從圖4可以看出，盡管隨著pH值的降低，該酶的活性受到一定的抑制，但是在pH3.5～4.5之間時仍然保持較高的活性。即說明JNC-U5菌株制備的脲酶制劑可用于釀酒生產(chǎn)。

2.5.2 脲酶制劑在釀酒中的應(yīng)用

將脲酶制劑按照一定量加入市售黃酒樣中，置于25℃條件下反應(yīng)，每隔24 h測定尿素的含量。測定結(jié)果（圖5）表明，添加脲酶制劑后24 h，尿素去除率可以達到78.5%，此后尿素去除率變化不大，48 h后尿素去除率超過80%。

圖5 尿素去除率

將JNC-U5菌株應(yīng)用于中溫大曲的生產(chǎn)，大曲各項理化性能結(jié)果如表4，糖化力提高了11.5%，液化力提高了9.7%，脲酶活力得到顯著提高，提高了141%。該曲藥應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，能有效去除生成EC的底物，大幅降低EC含量，確保了白酒食品安全性。

表4 大曲理化性能結(jié)果

3 討論

本研究篩選到1株產(chǎn)脲酶性能穩(wěn)定的菌株JNC-U5，該菌經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子生物學鑒定定性為聚多曲霉。該菌產(chǎn)脲酶活性為69.3 U/g，為脲酶的生產(chǎn)提供了寶貴的菌株資源。該菌種所產(chǎn)酶制劑在pH3.5～4.5環(huán)境下仍保持較高活性，在復(fù)雜的黃酒體系中仍能保持活性，24 h尿素去除率高達78.5%，48 h尿素去除率超過80%，說明其在酒類尤其是黃酒釀造中具有極大的應(yīng)用價值。

產(chǎn)脲酶菌株JNC-U5應(yīng)用于中溫大曲的生產(chǎn)，大曲糖化力提高了11.5%，液化力提高了9.7%，脲酶活力提高了141%。該大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)，能有效去除生成EC的底物，大幅降低EC含量，確保了白酒的食品安全性。同時，JNC-U5菌株的篩選成功也為生產(chǎn)酒用脲酶制劑提供了新的選擇，具有極大的應(yīng)用和推廣價值。