高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母菌種的選育與提高白酒酯香物質(zhì)含量的研究

張翠英，崔丹瑤，李 維，張 雨，馬紅霞

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457)

酯香物質(zhì)是白酒中的重要風(fēng)味成分，是白酒香氣的主要來源[1-2]。酯香物質(zhì)一般具有強(qiáng)烈的果香味或溶劑味，穿透力強(qiáng)，且閾值較低。白酒中的酯類主要有乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、丁二酸二乙酯等。我國高檔白酒中一般酯含量較高，但中低檔白酒中酯含量相對較低。如何適當(dāng)提高白酒中有積極作用的酯類物質(zhì)含量，一直是我國白酒行業(yè)和相關(guān)科研人員研究的熱點(diǎn)。

乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯屬于乙酸酯類，是白酒中最重要的一類活性香氣酯。各種香型白酒中乙酸乙酯占總酯量的比例均很高，尤其是在鳳香型、清香型、醬香型白酒中乙酸乙酯占總酯量的比例最高，西鳳酒、汾酒、茅臺酒中分別達(dá)60.14%、53.48%、38.28%。在各種香型高檔白酒中乙酸乙酯的含量不同，但都很高，汾酒、茅臺酒、習(xí)酒中乙酸乙酯含量分別為2627.9 mg/L[3]、1435.54～1769.81 mg/L[4]、1903.28 mg/L[5]。

1 釀酒酵母中乙酸酯的代謝機(jī)制

1.1 乙酸酯的合成

酯的合成途徑主要有兩種，化學(xué)合成和生物合成?；瘜W(xué)合成速度慢，合成量低，底物濃度要求高。在白酒發(fā)酵過程中，乙酸酯主要是由醇?；D(zhuǎn)移酶[6]或者其他酯合成酶在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)生物催化合成的（圖1）[7]。催化反應(yīng)需要能量來連接酰基輔酶A和基質(zhì)。乙酰輔酶A是釀酒酵母中含量最豐富的?；o酶A，既可以來源于丙酮酸的氧化脫羧，也可以由乙酸直接活化得到。大部分的乙酰輔酶A是由丙酮酸的氧化脫羧產(chǎn)生的。

圖1 酵母菌中乙酸乙酯的生物合成途徑[7]

醇乙?；D(zhuǎn)移酶（AATase）是酵母合成乙酸酯類（如乙酸乙酯、乙酸異戊酯等）的關(guān)鍵酶，催化醇類和乙酰輔酶A生成乙酸酯。早期研究發(fā)現(xiàn)[8-12]，有3種不同的醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶AATaseⅠ、Lg-AATaseⅠ和AATaseⅡ，分別由ATF1、Lg-ATF1和ATF2編碼。ATF1和ATF2在釀酒酵母和啤酒酵母中均存在，而Lg-ATF1只存在于啤酒酵母（巴斯德酵母）中。Malcorps和Dufour[13]通過實(shí)驗(yàn)得到了純化19000倍的AATase I，并估算出其分子量為57 kDa±3 kDa。研究證實(shí)，該酶的最適pH8.0，相對于乙酸異戊酯和乙酸乙酯的Km值是25 mmol/L和45 mmol/L，對異戊醇則是25 mmol/L。通過對釀酒酵母基因組進(jìn)行蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)，每個釀酒酵母單倍體基因組都含有一個ATF1基因。研究表明，ATF1的同源基因Lg-ATF1編碼的蛋白質(zhì)Lg-Atf1p與Atf1p一致性高達(dá)81%。Atf2p與Atf1p的一致性為36.9%[11]。

釀酒酵母乙酸酯代謝途徑[14]見圖2。大量研究結(jié)果證明，釀酒酵母AATase編碼基因ATF1和ATF2的表達(dá)水平密切影響乙酸乙酯和乙酸異戊酯的合成。除此之外，ATF1和ATF2基因編碼的酯合成酶還與很多微量揮發(fā)酯的生成有關(guān)，如乙酸丙酯，乙酸異丁酯，乙酸戊酯，乙酸己酯，乙酸庚酯，乙酸辛酯和乙酸苯乙酯。相比而言，ATF1基因的作用要大于ATF2基因的作用。

ATF1基因的表達(dá)水平受不飽和脂肪酸和氧氣抑制，受蛋白激酶SCh9和蛋白激酶A調(diào)控[15-18]。這些激酶通過改變碳、氮和磷酸鹽的含量來對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)發(fā)揮重要調(diào)控作用。Sch9主要調(diào)控參與細(xì)胞生長、糖和海藻糖代謝的基因。不同不飽和脂肪酸的影響與該脂肪酸的解鏈溫度密切相關(guān)，越低解鏈溫度的不飽和脂肪酸對ATF1的轉(zhuǎn)錄抑制越強(qiáng)烈。除了氧氣和不飽和脂肪酸的影響外，碳和氮的缺失也會對ATF1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制。這種情況下參與乙酸酯合成的酶活性下降。研究表明，ATF1基因的表達(dá)還受溫度和酒度的影響。

圖2 釀酒酵母乙酸酯代謝途徑[14

最近一篇研究報道，在酵母菌中發(fā)現(xiàn)了一個新的醇乙?；D(zhuǎn)移酶家族Eat1，可能是酵母菌中乙酸乙酯合成的主要酶[7]。在海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus）產(chǎn)乙酸乙酯過程中EAT1基因顯著上調(diào)；敲除乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）的EAT1基因，乙酸乙酯產(chǎn)生量降低80%。這個酶在所有產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌中都存在編碼基因序列[7]。

1.2 乙酸酯的水解

由釀酒酵母酯合成酶催化合成的酯還會被酵母產(chǎn)生的酯水解酶催化水解[19]。與酯合成相比，國內(nèi)外關(guān)于酯水解的研究較少。研究證實(shí)，酯合成酶與水解酶的平衡性是酯最終濃度的決定性因素[20]。酯酶由許多不同種類的水解酶組成，它們可以催化酯的分解，有時候也會促進(jìn)酯之間的締合。酯酶主要通過以下反應(yīng)催化酯的分解：RCOOR+H2O→ROH+RCOOH。

對葡萄酒的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IAH1基因可以導(dǎo)致乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯的濃度顯著降低[21]。對清酒的研究發(fā)現(xiàn)，IAH1基因缺失的清酒酵母菌株所產(chǎn)乙酸異戊酯的濃度遠(yuǎn)高于野生清酒酵母菌株，乙酸異丁酯的產(chǎn)量較野生清酒酵母菌株也有增加。因此，研究認(rèn)為Iah1p可以水解乙酸異戊酯。

對酯水解酶的三維結(jié)構(gòu)分析顯示，有α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-片狀結(jié)構(gòu)兩種水解酶。催化主要有3個重要元素組成：絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸，在活性位點(diǎn)上通常具有這樣一種共同序列：甘氨酸-X-絲氨酸-X-甘氨酸。這種三元催化系統(tǒng)還存在于其他一些酶中，如硫酯水解酶、蛋白酶、環(huán)氧化物水解酶等。研究證實(shí)，絲氨酰-組氨酸以及相似的二肽可以自行切割DNA和蛋白質(zhì)。另外，很可能還存在其他一些酶與酯的水解有關(guān)如絲氨酸蛋白酶。

酶的活性很大程度上取決于乙酸酯主鏈的長度，而不是它的結(jié)構(gòu)（直鏈或者支鏈）。如圖3所示，Iah1p對乙酸異丁酯的親和力和作用力更強(qiáng)[22]。

圖3 Iah1p對乙酸酯類的底物特異性（設(shè)定對乙酸異丁酯的相對活性為100%）[22]

2 高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母菌種的選育

乙酸酯是釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分中最重要的一類，構(gòu)成了高質(zhì)量酒的果香成分。乙酸酯的濃度主要是受ATF1和ATF2基因的調(diào)控。釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)影響ATF1和ATF2基因表達(dá)的因素都會影響乙酸酯的終濃度。

通過基因敲除缺失釀酒酵母酯水解酶（Esterase）編碼基因IAH1，發(fā)酵結(jié)果顯示，重組菌株IY1與親本菌株RY1相比，乙酸乙酯含量提高到47.4 mg/L，提高了46%；乙酸異丁酯、乙酸異戊酯以及相關(guān)高級醇（異丁醇、異戊醇）的產(chǎn)量均沒有明顯變化[23]（表1）。研究表明釀酒酵母酯水解酶編碼基因IAH1的缺失可以提高其乙酸乙酯的產(chǎn)量，而對乙酸異戊酯和乙酸異丁酯沒有任何影響。

表1 突變株IY1與親本菌株RY1酯醇產(chǎn)生量(mg/L)

選用PGK1作為啟動子，利用同源重組技術(shù)，在過表達(dá)釀酒酵母編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶I的ATF1基因的同時，將釀酒酵母基因組中編碼酯水解酶的IAH1基因敲除，獲得了釀酒酵母基因工程菌EY1。與釀酒酵母親本菌株RY1相比，在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，模擬半固態(tài)發(fā)酵后，異戊醇含量降低了約50%，乙酸乙酯含量提高了近20倍，乙酸異戊酯的含量提高到100 mg/L，乙酸異丁酯含量提高到5～7 mg/L（表2）；模擬固態(tài)發(fā)酵后，總酯提高了4倍，其中乙酸乙酯提高了近35倍[24]。

表2 突變株EY1與親本菌株RY1酯醇產(chǎn)生量(mg/L)

選用PGK1作為啟動子，利用同源重組技術(shù)，在過表達(dá)釀酒酵母編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶II的ATF2基因的同時，將釀酒酵母基因組中編碼酯水解酶的IAH1基因敲除，獲得了釀酒酵母基因工程菌EY2。與釀酒酵母親本菌株RY1相比，在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，模擬半固態(tài)發(fā)酵后，乙酸乙酯含量提高3.9倍，乙酸異戊酯的含量提高到26.68 mg/L，乙酸異丁酯含量提高到7.60 mg/L[25-26]（表3）。

表3 突變株EY2與親本菌株RY1酯醇產(chǎn)生量(mg/L)

選用強(qiáng)啟動子PGK1將釀酒酵母中特有的編碼醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶Lg-I的Lg-ATF1基因在釀酒酵母中高效表達(dá)，得到含有Lg-ATF1基因的釀酒酵母工程菌EY3。該菌在其他發(fā)酵性能不受影響的情況下，與親本菌株RY1相比：模擬半固態(tài)發(fā)酵后，乙酸乙酯含量提高1.5倍，乙酸異戊酯的含量提高到8.66 mg/L[25-26]（表4）。

表4 突變株EY3與親本菌株RY1酯醇產(chǎn)生量(mg/L)

3 高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母在白酒中的應(yīng)用

利用改良的高產(chǎn)酯釀酒酵母（1種酵母）取代目前復(fù)合生香酵母（1種釀酒酵母+4種生香酵母）生產(chǎn)芝麻香型白酒，可減化芝麻香型白酒生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率。生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明，理化指標(biāo)、原酒色譜數(shù)據(jù)與原料出酒率與對照組無明顯差異，感官品評結(jié)果，試驗(yàn)組較對照組芝麻香較成熟、清、帶甜香味，較醇和（表5）。說明高產(chǎn)酯釀酒酵母可代替復(fù)合酵母生產(chǎn)芝麻香型白酒，且芝麻香基酒的典型性更好，優(yōu)質(zhì)酒率可提高30%以上。

利用高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母，進(jìn)行清香型酒丟糟配糧發(fā)酵生產(chǎn)高酯調(diào)味酒試驗(yàn)[27-28]。發(fā)酵周期（6 d）縮短至原來的1/5，車間生產(chǎn)效率提高約8倍；乙酸乙酯和總酯含量明顯提高，高級醇含量有所下降，清香更顯突出；基酒中總酯含量高于5000 mg/L，乙乳比提高至3.0左右，適合于用來勾調(diào)夏季生產(chǎn)時乳酸乙酯含量偏高的基酒（表6）。

表5 原酒感官品評描述

表6 清香型白酒生產(chǎn)試驗(yàn)原酒主要成分比較(mg/L)

4 結(jié)論

乙酸酯是白酒中最重要的一類活性香氣酯，對白酒產(chǎn)品風(fēng)味與品質(zhì)具有重要影響。在白酒發(fā)酵過程中，乙酸酯主要是在酵母細(xì)胞中由醇?；D(zhuǎn)移酶或者其他酯合成酶催化合成的。大量研究結(jié)果證明釀酒酵母AATase編碼基因ATF1的表達(dá)水平是影響乙酸乙酯和乙酸異戊酯合成的關(guān)鍵因素。最近也有研究報道在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的新的醇乙?；D(zhuǎn)移酶家族Eat1可能是酵母菌中乙酸乙酯合成的主要酶。由釀酒酵母酯合成酶催化合成的酯還會被酵母產(chǎn)生的酯水解酶（IAH1基因編碼酯水解酶）催化水解。研究證實(shí)酯合成酶與水解酶的平衡性是酯最終濃度的決定性因素。

通過敲除編碼酯水解酶的IAH1基因，過表達(dá)編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶的ATF1、ATF2、Lg-ATF1基因可以獲得高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母菌株，乙酸乙酯含量分別提高了0.46倍、20倍、3.9倍、1.5倍；過表達(dá)ATF1、ATF2、Lg-ATF1基因菌株乙酸異戊酯的含量分別提高到100 mg/L、26.68 mg/L、8.66 mg/L。

選育的高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株應(yīng)用到白酒生產(chǎn)中，可顯著改善白酒產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)。芝麻香型白酒生產(chǎn)應(yīng)用試驗(yàn)顯示，高產(chǎn)酯釀酒酵母菌株的應(yīng)用可減化芝麻香型白酒生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率，且芝麻香基酒的典型性更好，優(yōu)質(zhì)酒率可提高30%以上。清香型酒丟糟配糧發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)顯示，發(fā)酵周期大大縮短，車間生產(chǎn)效率提高；乙酸乙酯和總酯含量明顯提高，高級醇含量有所下降，清香更顯突出。