高效液相色譜同時測定葡萄酒中12種酚含量的研究

田 超，侯紅萍

（山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院山西太谷030801）

多酚類物質(zhì)是葡萄酒的重要功能成分。其中的無色多酚類又可分為類黃酮、酚酸、芪類物質(zhì)等物質(zhì)。葡萄酒中多酚物質(zhì)的保健作用，特別是白藜蘆醇對心腦血管的保護作用日益突顯并被消費者廣泛接受[1]，因此葡萄酒中多酚含量也成為葡萄酒生產(chǎn)及市場關注的重要指標。目前葡萄酒中的多酚類檢測儀器以高效液相色譜及高效液相色譜-質(zhì)譜連用[2]為主。而高效液相色譜檢測多酚類物質(zhì)的方法，亦廣泛應用于葡萄酒與健康、葡萄酒工藝[3]、釀酒葡萄栽培[4]等學術研究領域。

目前已有的高效液相色譜檢測多酚方法的研究很多。但隨著對白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的研究，有報道表示白藜蘆醇苷可作為整體被生物吸收利用[5]，獨立完成某些保健功能。因此試驗嘗試建立一種包含白藜蘆醇苷在內(nèi)的葡萄酒多酚同時檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

Agilent U3000高效液相色譜儀（包括色譜泵，自動進樣器，DAD-UV紫外檢測儀），Scientific Thermo Hypersil Gold 250×4.6mm 5μm液相色譜柱。HPLC級標準品：兒茶素，沒食子酸，楊梅素，香草酸，表兒茶素，阿魏酸，白藜蘆醇苷，蘆丁，白藜蘆醇，槲皮素，山萘酚。HPLC級試劑：超純水，乙腈，乙酸（38%，v/v）。

1.2 樣品萃取

萃取采用以韓國民等方法[6]的一種改進方法：取葡萄酒樣30 mL，加入30 mL乙酸乙酯，以搖床低速搖勻30 min萃取，共3次，合并有機相后置于薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃下）蒸發(fā)至干，后用2 mL乙腈溶解，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，制成樣品備用。

1.3 標準溶液的配制

取沒食子酸等12種標準品各20 mg，溶于10 mL乙腈，并依梯度稀釋至5～150 mg/L配制成標準溶液及混合標準溶液，所有樣品使用前于-30℃溫度條件下保存。

1.4 最佳檢測波長

通過已有文獻結(jié)合實際檢測確定最佳紫外檢測波長為280 nm。對咖啡酸的檢測應使用320 nm。

1.5 色譜條件的確定

已有文獻表示：葡萄酒中無色單體酚的檢測多采用有機相+酸+水的流動相組合[7]，并采用梯度洗脫程序[8]。而白藜蘆醇的檢測，流動相大多為有機相（甲醇[9]或乙腈[10]）和水的混合配比。且流動相中的有機相-水，在一定比例下調(diào)整，對白藜蘆醇出峰時間有較大影響，而對洗脫回收率影響不大[11]。

綜合考慮，色譜條件采用：采取流動相A：水+乙酸4%（v/v），流動相B：乙腈的搭配方法。并設定進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速1.0 μL/min。

以已有的方法為基礎[12]，結(jié)合白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的檢測需要，設置一種改進的梯度洗脫程序，見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 各種物質(zhì)保留時間的確定

分別對12種物質(zhì)標準品單獨進樣，記錄保留時間。再對混合標準溶液進樣獲得檢測圖譜如圖1、圖2，檢查各峰并對比保留時間，各物質(zhì)出峰清晰，分離度滿意。

圖1 在280 nm檢測波長下12種單體酚標準品色譜圖

圖2 在320 nm檢測波長下12種單體酚標準品色譜圖

由圖1、圖2可知，香草酸在320 nm檢測波長下無較強吸收，與孫翔宇等[12]研究結(jié)果相同。故使其可與保留時間相對接近的咖啡酸相區(qū)別。因此在以下分析中，咖啡酸采用320 nm波長檢測通道的數(shù)據(jù)，其余物質(zhì)使用280 nm波長檢測通道下的數(shù)據(jù)。

2.2 各物質(zhì)保留時間和標準曲線

對各個不同濃度梯度混合標樣進樣，建立標準曲線，結(jié)果如表2。12種單體酚含量與檢測值之間線性關系良好，線性相關系數(shù)均大于0.999，符合檢測需求。各單體酚最低檢測線較低，能符合定量檢測要求，靈敏度相對較高。

2.3 重復性測試

在上述液相色譜條件下，取同一標樣連續(xù)進樣6次，記錄其保留時間（表3）和峰面積（表4）。

2.4 穩(wěn)定性測試

取6個間隔時間不同的標準品進行進樣檢測，記錄各物質(zhì)檢測峰面積，如表4。

經(jīng)統(tǒng)計分析，各物質(zhì)保留時間的RSD值均較小，遠低于2%。標準品峰面積差值RSD均低于5%。液相色譜工作重復性、穩(wěn)定性良好。

2.5 加標回收率

根據(jù)樣品中不同物質(zhì)含量不同，選擇添加相應合適濃度的標樣重復測量5次。依照公式計算加標回收率。結(jié)果如表5。

由表5可知，每種單體酚加標回收率均大于80%，大于檢測可接受下限。RSD均小于5%，檢測方法可行。

表2 單體酚的標準曲線

表3 各單體酚重復進樣6次的保留時間

2.6 葡萄酒樣品測定

葡萄酒酒樣來自市售及酒莊贊助。葡萄采摘年份均為2010年。以上述色譜條件進行單體酚檢測，每種酒樣重復3次。葡萄酒酒樣進樣獲得檢測圖譜如圖3、圖4，單體酚含量分析結(jié)果見表6。

表4 各單體酚重復進樣6次的峰面積

表5 加標回收率

表6 山西省不同子產(chǎn)區(qū)葡萄酒單體酚含量

圖3 在280 nm檢測波長下葡萄酒樣品色譜圖

圖4 在320 nm檢測波長下葡萄酒樣品色譜圖

3 結(jié)論與展望

葡萄酒內(nèi)的總酚及單體酚含量仍然是未來葡萄酒領域持續(xù)關注的重要問題。高效液相色譜在可溶性高沸點有機物分離檢測上仍占據(jù)核心地位。通過本次試驗，建立了一種基于4.6 mm色譜柱，280 nm和320 nm檢測波長，以水、冰乙酸、乙腈為流動相的葡萄酒單體酚檢測方法。并對該方法的分離度、重復性、穩(wěn)定性，加標回收率等指標進行了考察，結(jié)果滿意。以此檢測方法對山西省不同地區(qū)幾款葡萄酒進行了檢測。使該檢測方法可為葡萄酒類研究提供一種單體酚的快速檢測方法。