黃酒酵母的性能改良及降低其產(chǎn)物中氨基甲酸乙酯含量的研究

方逸群，倪 斌

（上海金楓酒業(yè)股份有限公司，上海200051）

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是發(fā)酵食品中普遍存在的代謝產(chǎn)物，是在酒類(lèi)的加工過(guò)程中產(chǎn)生的，廣泛存在于發(fā)酵酒如葡萄酒、黃酒等產(chǎn)品中[1]。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)將 EC 列入Group 2A組，是人類(lèi)可能的致癌物。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織下的食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives,JECFA)對(duì)所有食品EC污染物開(kāi)展的系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究表明，EC的食品安全風(fēng)險(xiǎn)主要源于高EC含量的酒精飲料，建議采取預(yù)防措施降低飲料酒中氨基甲酸乙酯含量。國(guó)際權(quán)威組織機(jī)構(gòu)已經(jīng)明確建議降低酒精飲料中氨基甲酸乙酯含量并將其作為食品法典修訂的參考依據(jù)。因此，目前EC及其前體代謝物質(zhì)的生成機(jī)制已成為食品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

黃酒是我國(guó)最具代表性的發(fā)酵酒類(lèi)，其EC含量普遍高于國(guó)際上其他常見(jiàn)酒種。尿素是生成EC的重要前體物質(zhì)，經(jīng)酵母代謝可生成氨基甲酸乙酯。尿素普遍存在于發(fā)酵食品的原料及生產(chǎn)過(guò)程中，黃酒中大部分的EC由尿素與乙醇反應(yīng)生成。黃酒中富含各種氨基酸，研究表明，L-精氨酸等是尿素的主要前體物質(zhì)。黃酒釀造過(guò)程中，酒體中的精氨酸在精氨酸酶作用下代謝形成尿素，尿素與乙醇反應(yīng)最終形成EC[2-6]。因此，控制黃酒酵母發(fā)酵過(guò)程中尿素的生成是黃酒中EC預(yù)防控制措施最為關(guān)鍵的手段之一。

除控制原料中不慎帶入的少量尿素外，降低黃酒中尿素含量的方法主要有：添加脲酶降解尿素，從而降低EC含量[7-8]；自然突變、誘變、雜交等方法的菌種選育[9]；構(gòu)建基因敲除或基因過(guò)表達(dá)的基因改良菌株[10-15]。本研究以黃酒酵母JF501為原始菌株，比較紫外誘變和基因過(guò)表達(dá)兩種不同的改良方法，獲得低產(chǎn)尿素的酵母菌株，從而降低產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料和菌種

14°Bx米曲汁發(fā)酵液，上海石庫(kù)門(mén)釀酒有限公司；Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒、抽質(zhì)粒試劑盒、內(nèi)切酶、DNA Marker，大連Takara公司。

JF501黃酒酵母，上海石庫(kù)門(mén)釀酒有限公司；大腸埃希氏菌(Escherichia coli)Top10、pYX212質(zhì)粒，上海復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(yeast peptone dextrose,YPD)：2%蛋白胨、1%酵母粉、2%葡萄糖、2%瓊脂。

初篩培養(yǎng)基采用刀豆氨酸-精氨酸-鳥(niǎo)氨酸培養(yǎng)基(canavanine arginine ornithine,CAO)：0.17%酵母碳源基礎(chǔ)(yeast carbon base,YCB)培養(yǎng)基(不含氮)、刀豆氨酸10 mg/L、精氨酸1 mmol/L、鳥(niǎo)氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂。

復(fù)篩培養(yǎng)基采用（1）精氨酸培養(yǎng)基(arginine medium,AM)：0.17%YCB培養(yǎng)基(不含氮)、精氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂；（2）鳥(niǎo)氨酸培養(yǎng)基(ornithine medium,OM)：0.17%YCB培養(yǎng)基(酵母碳源基礎(chǔ)，不含氮)、鳥(niǎo)氨酸5 mmol/L、2%葡萄糖、2%瓊脂。

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉(固體培養(yǎng)基加2%瓊脂)。

1.1.3 主要化學(xué)試劑及溶液的配制

醋酸鋰(分析純)；EC標(biāo)準(zhǔn)品(優(yōu)級(jí)純)；氫氧化鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)；磷酸(分析純)、硫酸(分析純)、二乙酰一肟(分析純)、氨基硫脲(分析純)：上海虹口東風(fēng)化學(xué)試劑有限公司。

酸鐵溶液的配制：100 mL磷酸和300 mL硫酸，加到含有0.1 g三氯化鐵的600 mL蒸餾水中。

二乙酰一肟溶液的配制：稱(chēng)取二乙酰一肟0.900 g，溶于80℃左右的蒸餾水中，定容至50 mL棕色容量瓶中。

氨基硫脲溶液的配制：稱(chēng)取氨基硫脲0.030 g，溶于80℃左右的蒸餾水中，定容至50 mL棕色容量瓶中。

尿素檢測(cè)顯色劑的配制：臨用前取二乙酰一肟溶液:氨基硫脲(1∶1，V/V)混勻，2 h內(nèi)有效。

尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱(chēng)取尿素0.100 g，用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為1000μg/mL。

尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別移取質(zhì)量濃度為1000μg/mL尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL，分別定容至100 mL容量瓶中，尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度分別為10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL。

1.1.4 儀器設(shè)備

DNP-9272生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS210S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；PTC-200型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀，美國(guó)MJ Research公司；FR-250型電泳儀，上海復(fù)日科技有限公司；UV-2102紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；2695高效液相色譜儀，沃特世科技(上海)有限公司；5975C氣相色譜儀、6890N質(zhì)譜儀、萃取頭為65 μm PDMS/DVB固相微萃取，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種改良方法

（1）紫外誘變

對(duì)原始菌種黃酒酵母JF501分別進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的紫外照射，照射距離30 cm，誘變時(shí)間0.5 min、1.0 min、2.0 min、3.0 min、4.0 min、5.0 min。誘變后進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，并使用CAO培養(yǎng)基為初篩培養(yǎng)基，精氨酸培養(yǎng)基(AM)及鳥(niǎo)氨酸培養(yǎng)基(OM)為復(fù)篩培養(yǎng)基，在AM上不生長(zhǎng)而在OM上生長(zhǎng)的酵母菌株即可判斷為目的菌株——精氨酸酶缺陷型酵母菌株。改良菌株在發(fā)酵過(guò)程中無(wú)法分解精氨酸產(chǎn)生尿素，從而降低了產(chǎn)品中尿素的含量，進(jìn)一步能降低EC的含量[16]。紫外誘變的篩選原理見(jiàn)圖1。誘變率、致死率計(jì)算公式如下：

誘變率=誘變后改良菌落數(shù)/對(duì)照組菌落數(shù)×100%；

致死率=(對(duì)照組菌落數(shù)－誘變后仍存活的菌落數(shù))/對(duì)照組菌落數(shù)×100%。

（2）黃酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

構(gòu)建含有脲基酰胺酶基因編碼框的重組表達(dá)載體pYX212-DUR1,2及含抗生素標(biāo)記的共轉(zhuǎn)載體pYX212-Sh ble的重組酵母菌株，通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方式(醋酸鋰法)將其轉(zhuǎn)入原始菌株JF501，并使用含有抗生素博萊霉素(zeocin)的選擇性完全培養(yǎng)基(YPD)進(jìn)行篩選，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，獲得改良菌株[17-18]。表1列出主要引物序列，其中引物1、引物2用于構(gòu)建表達(dá)載體，引物3、引物4用于構(gòu)建共轉(zhuǎn)載體，引物5、引物2用于鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

圖1 紫外誘變篩選示意圖

1.2.2 發(fā)酵試驗(yàn)方法

（1）發(fā)酵性能試驗(yàn)

將菌株于米曲汁瓊脂斜面上劃線(xiàn)30℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化；取活化后菌種1環(huán)接入14°Bx的米曲汁發(fā)酵液中，30℃培養(yǎng)24 h，并將該酵母種子液濃度調(diào)整至107個(gè)/mL；將種子液接種至14°Bx的三角瓶米曲汁發(fā)酵液中，30℃恒溫培養(yǎng)，每24 h稱(chēng)質(zhì)量1次，當(dāng)失重＜0.2 g/d時(shí)，認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。

（2）發(fā)酵釀酒試驗(yàn)

分別采用獲得的改良菌株與原始菌株進(jìn)行黃酒的發(fā)酵試驗(yàn)。將菌株活化制成酒母，按表2比例投料，進(jìn)行模擬發(fā)酵釀酒試驗(yàn)。投料溫度控制在28℃，經(jīng)過(guò)前發(fā)酵、后發(fā)酵、壓榨、煎酒后獲得黃酒產(chǎn)品。

1.2.3 分析檢測(cè)

表1 主要引物序列

表2 釀酒試驗(yàn)投料比例

（1）黃酒常規(guī)理化指標(biāo)檢測(cè)

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662—2008《黃酒》中的方法，測(cè)定黃酒的酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)。

（2）精氨酸含量的檢測(cè)

參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法》中的方法，測(cè)定黃酒中精氨酸含量。

（3）尿素含量的檢測(cè)

采用分光光度計(jì)法測(cè)定尿素含量。取不同質(zhì)量濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液200 μL于試管中，再分別加入3 mL酸鐵溶液和1 mL顯色劑，蓋上塞子搖勻。置于沸水浴中反應(yīng)15 min，取出后冰水迅速冷卻3 min，并用蒸餾水定容至10 mL，搖勻。在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定其吸光度值，繪制尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[19]。

樣品按相同處理后進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算樣品中尿素含量。

（4）EC含量的檢測(cè)[20]

吸取100 mL不同濃度的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液(20μg/L、50μg/L、100 μg/L、200 μg/L)于三角瓶中，加入1.5 mL、300 g/L的NaOH溶液，混勻；吸取5 mL上述溶液，加入2 g NaCl，混勻；采用固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)于70℃頂空吸附15 min；240℃下解析1 min，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)進(jìn)行EC含量分析檢測(cè)。

氣相色譜(GC)條件：毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度220℃；升溫程序：初始溫度35℃(0 min)，以5℃/min升至80℃，再以15℃/min升至110℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣(分流比60∶1)；載氣：高純氦氣(純度99.999%)、載氣流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜(MS)條件：電子電離(electron ionization,EI)源，離子源溫度250℃，電子能量70 eV，接口溫度230℃，電子倍增器電壓1568 V，檢測(cè)離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62，同時(shí)m/z 50～200全掃描進(jìn)行驗(yàn)證。

使用SPME固相微萃取前處理方法，結(jié)合GCMS外標(biāo)法檢測(cè)黃酒中EC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以尿素質(zhì)量濃度為(x)橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=0.0062x-0.0075，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，表明尿素質(zhì)量濃度和吸光度值在10～100μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，因此，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)滿(mǎn)足黃酒中尿素含量的測(cè)定要求。

2.2 改良菌株的獲得

2.2.1 紫外誘變

以黃酒酵母JF501為原始菌株，進(jìn)行不同時(shí)間的紫外誘變，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基篩選，選出精氨酸酶缺陷型酵母代表菌株，不同誘變時(shí)間的紫外誘變結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，根據(jù)改良菌株釀酒試驗(yàn)獲得的產(chǎn)品中尿素含量，經(jīng)過(guò)紫外誘變，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩后獲得6株菌，發(fā)酵產(chǎn)品中尿素的含量均低于對(duì)照組，說(shuō)明紫外誘變獲得了低產(chǎn)尿素的菌株。分析表3的結(jié)果，誘變時(shí)間在0.5～5.0 min時(shí)，隨著誘變時(shí)間的增加，致死率升高、突變率提高(其中誘變時(shí)間4 min時(shí)的突變率最高)、產(chǎn)品中尿素含量減少(其中誘變時(shí)間5 min尿素含量最低)；誘變時(shí)間＞5 min(數(shù)據(jù)未列出)致死率進(jìn)一步升高，但突變率和尿素含量變化不明顯。因此紫外誘變時(shí)間在4 min及5 min為宜，選擇JF501-A62、JF501-A83進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵性能試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選。

表3 不同誘變時(shí)間的紫外誘變結(jié)果

2.2.2 黃酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定

構(gòu)建重組表達(dá)載體pYX212-DUR1,2及含抗生素標(biāo)記的共轉(zhuǎn)載體pYX212-Sh ble的重組酵母菌株，通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方式(醋酸鋰法)將其轉(zhuǎn)入原始菌株JF501，并使用含有抗生素博萊霉素(zeocin)的選擇性完全培養(yǎng)基(YPD)進(jìn)行篩選，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

由圖3可知，1—4為篩選到含有DUR1，2基因的菌株，PCR得到引物5、引物2擴(kuò)增的條帶大小為5.5 kb，但未含有啟動(dòng)子TPI1；5為PCR得到引物5、引物2擴(kuò)增出來(lái)的條帶，說(shuō)明啟動(dòng)子TPI1及DUR1,2已同時(shí)整合到酵母中。因此5為1株DUR1,2過(guò)表達(dá)酵母菌種，命名為JF501-B5。

2.2.3 發(fā)酵性能試驗(yàn)

黃酒酵母的發(fā)酵度是重要的發(fā)酵特性之一，它反映了酵母對(duì)糖的利用能力。黃酒酵母菌發(fā)酵米曲汁時(shí)釋放CO2，使發(fā)酵液質(zhì)量損失。因此根據(jù)發(fā)酵液的質(zhì)量損失速率可以大致了解其發(fā)酵速率。

（1）紫外誘變菌株

將紫外誘變菌株JF501-A62、JF501-A83進(jìn)行發(fā)酵性能試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為144 h，檢測(cè)發(fā)酵液的各種理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖4和表4。由圖4可知，誘變菌株JF501-A62的發(fā)酵速率達(dá)到與原始菌株相近的水平，而JF501-A83發(fā)酵速率初期緩慢，后期逐步提升至與原始菌株相近的水平，說(shuō)明JF501-A62發(fā)酵速率與原始菌株更相近、更能符合發(fā)酵需求，而JF501-A83初期發(fā)酵緩慢，容易使酒體寡淡無(wú)味，因此在發(fā)酵性能方面JF501-A62更優(yōu)。

圖4 紫外誘變菌種發(fā)酵速率

由表4可知，與JF501相比，誘變菌株的總質(zhì)量損失、總糖含量及總酸含量基本不變，JF501-A62的酒精度與原始菌種相近，但JF501-A83的產(chǎn)酒精能力大大下降，酒精度僅為5.37%vol，無(wú)法滿(mǎn)足釀酒需求。因此綜合發(fā)酵速率及各項(xiàng)理化指標(biāo)的對(duì)比，選擇誘變菌株JF501-A62為紫外誘變的最佳改良菌株。

表4 紫外誘變菌株發(fā)酵性能試驗(yàn)結(jié)果

（2）基因過(guò)表達(dá)菌株

將基因過(guò)表達(dá)菌株JF501-B5進(jìn)行發(fā)酵性能試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為144 h，檢測(cè)發(fā)酵液的各種理化指標(biāo)，結(jié)果如圖5及表5所示。由圖5可知，JF501-B5在發(fā)酵初期發(fā)酵速率比原始菌株快，后期與原始菌株持平，說(shuō)明菌株JF501-B5發(fā)酵速率與原始菌株相近，可以滿(mǎn)足發(fā)酵需求。

圖5 基因過(guò)表達(dá)菌種發(fā)酵速率圖

表5 基因過(guò)表達(dá)菌株發(fā)酵性能試驗(yàn)

由表5可知，基因過(guò)表達(dá)菌株發(fā)酵液的總質(zhì)量損失、總糖、總酸和酒精度與原始菌株發(fā)酵液無(wú)明顯差異，且產(chǎn)品中尿素含量大大降低，由32.15 mg/L降至3.84 mg/L，因此可判定JF501-B5能夠正常發(fā)酵，為基因過(guò)表達(dá)的改良菌株。

綜合上述發(fā)酵性能試驗(yàn)結(jié)果，篩選出紫外誘變菌株JF501-A62及基因過(guò)表達(dá)菌株JF501-B5，進(jìn)行下一步釀酒試驗(yàn)研究。

2.3 改良菌株進(jìn)行釀酒試驗(yàn)獲得的產(chǎn)品指標(biāo)比較

將JF501-A62、JF501-B5和JF501作為酒母菌種，對(duì)發(fā)酵后的黃酒進(jìn)行常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6；精氨酸、尿素及EC含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

由表6可知，2株菌株均正常發(fā)酵，獲得黃酒產(chǎn)品。與原始菌株相比，改良菌株釀造的黃酒出酒率、酒精度、總糖、總酸及氨基酸態(tài)氮沒(méi)有明顯的差異，且各發(fā)酵產(chǎn)物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662—2008《黃酒》的要求。

由表7可知，與原始菌株相比，JF501-A62由于是精氨酸酶缺陷型，精氨酸無(wú)法正常代謝生成尿素，因此產(chǎn)品中累積較多的精氨酸含量；JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)品中精氨酸含量則與原始菌株基本持平，而兩者產(chǎn)品中尿素和EC含量均有顯著降低，JF501-A62發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了67%，EC含量降低了59%；JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了88%，EC含量降低了63%。經(jīng)過(guò)6個(gè)月貯存期，3個(gè)產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量都有所增加，但JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量始終最低，且增加量最少。說(shuō)明JF501-B5在降低產(chǎn)品中尿素、EC含量方面更優(yōu)，是最佳的改良菌株。

表6 原始菌株與改良菌株釀酒產(chǎn)品常規(guī)理化指標(biāo)的比較

表7 原始菌株與改良菌株釀酒產(chǎn)品精氨酸、尿素、EC含量的比較

3 結(jié)論

本研究通過(guò)紫外誘變和基因重組試驗(yàn)，篩選獲得2株改良黃酒酵母菌種，即紫外誘變菌株JF501-A62和基因過(guò)表達(dá)菌株JF501-B5。經(jīng)過(guò)改良菌種發(fā)酵獲得黃酒產(chǎn)品及對(duì)其理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)可知，與原始菌株相比，改良菌株釀造的發(fā)酵性能和黃酒的出酒率、酒精度、總糖、總酸及氨基酸態(tài)氮沒(méi)有明顯的差異。而誘變菌株JF501-A62發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了67%，EC含量降低了59%；基因過(guò)表達(dá)菌株JF501-B5發(fā)酵產(chǎn)物尿素含量降低了88%，EC含量降低了63%。兩者均有很好的發(fā)酵性能，并取得了較好地降低產(chǎn)品中尿素含量，進(jìn)而降低氨基甲酸乙酯含量的效果。與紫外誘變相比，基因過(guò)表達(dá)的改良方法獲得了尿素含量更低的菌株，并在一段時(shí)間的貯存期之后產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯含量更低。這一菌株改良方法能有效降低黃酒中EC的含量，為解決黃酒行業(yè)中存在的由氨基甲酸乙酯造成的潛在食品安全問(wèn)題打下扎實(shí)基礎(chǔ)。