國(guó)產(chǎn)氟多功能模塊自動(dòng)化合成18F-6-氟-L-DOPA及其臨床初步應(yīng)用

付華平，張曉軍，麻廣宇，劉 健，徐曉丹，徐白萱，張錦明

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853)

對(duì)分化良好、糖代謝水平低的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NETs)，18F-6-氟-L-DOPA(18F-DOPA)比18F-FDG具有更高的診斷價(jià)值[1]，歐洲將18F-DOPA寫入神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷指南[2]。但由于親電合成需要?dú)怏w靶，且放化產(chǎn)率低和含載體，而親核合成工藝復(fù)雜[3]，18F-DOPA在臨床推廣應(yīng)用有一定的難度。近年來(lái)，親核取代法合成18F-DOPA取得了較大的進(jìn)展，除間接親核取代后采用手性催化劑合成18F-DOPA外，直接親核取代水解合成18F-DOPA方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，且不含載體、產(chǎn)品手性純度高，受到臨床的歡迎。文獻(xiàn)報(bào)道了多種直接親核取代合成18F-DOPA的方法，其中以碘鹽或硼酸酯為前體的合成方法，可以在常規(guī)的氟多功能模塊上實(shí)現(xiàn)大劑量、自動(dòng)化的合成，使18F-DOPA在臨床的廣泛應(yīng)用成為可能[4]。本研究在Tredwell等[5]的研究基礎(chǔ)上，以6-硼酯-二甲氧基-DOPA為前體，銅鹽Cu(OTf)2(py)4為催化劑，在國(guó)產(chǎn)氟多功能模塊上實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、快速合成18F-DOPA，經(jīng)質(zhì)控和倫理審批后，進(jìn)行了初步的臨床評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA和銅鹽Cu(OTf)2-(py)4：德國(guó)ABX產(chǎn)品；19F-6-氟-L-DOPA標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大TRC公司；Sep-Pak Light QMA柱、SEP-PAK C18柱：美國(guó)Waters公司；氧-18水(H18O豐度大于97%)、氨基聚醚(kryptofix，K2.2.2)：江蘇華益科技有限公司；碳酸鉀(K2CO3)：純度>99.997%，美國(guó)STREM公司；氫氧化鈉(NaOH)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸(CH3COOH)、抗壞血酸、丙酮：分析純，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品； 無(wú)水乙腈(CH3CN)：純度>99.9%，美國(guó)Aldrich公司產(chǎn)品；57%氫碘酸(HI)：AR，百靈威化學(xué)試劑。

1.2 主要設(shè)備

Sumitomo HM-20S回旋加速器：日本住友公司；PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊：派特(北京)科技有限公司；高效HPLC分析儀：美國(guó)Waters公司，配515泵，2487紫外檢測(cè)器，Phenomenex Gemini 100 A C18 (4.6 mm×150 mm)分析柱，BioScan流動(dòng)放射性檢測(cè)器；Discovery ST64 PET/CT掃描儀：美國(guó)GE公司；便攜式內(nèi)毒素快速檢測(cè)儀：美國(guó)Charles River公司；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)：德國(guó)斯派克分析儀器公司；Bante321-Cu便攜式銅離子濃度計(jì)：上海般特。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

正常雄性NIH小鼠5只，6～8周齡，(20±5) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2015．0001。

1.4 臨床患者

經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意(批準(zhǔn)號(hào)：S2017-128-01)，正常受試者：男性一例，52歲；胰島細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者：女性一例，22歲；簽署知情同意書。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 18F-DOPA的自動(dòng)化合成

使用PET-MF-2V-IT-Ⅰ型氟多功能合成模塊合成18F-DOPA，合成線路示于圖1。具體步驟：加速器經(jīng)18O(p,n)18F反應(yīng)得到18F-由N2載帶至QMA捕獲，用1.0 mL K2.2.2/K2CO3淋洗液(由5.50 g/L K2CO3水溶液0.2 mL和18.75 g/L K2.2.2乙腈溶液0.8 mL混合而成)將18F-從QMA柱洗入1號(hào)反應(yīng)管，通入N2并加熱115 ℃除水至干，再將2 mL乙腈加入反應(yīng)管繼續(xù)通氣加熱除水至干燥。10 mg 6-硼酯-二甲氧基-DOPA/10 mg Cu(OTf)2(py)4)溶于0.7 mLDMF溶液中，加入1號(hào)反應(yīng)管，110 ℃密閉親核取代反應(yīng)10 min后，加10 mL水稀釋反應(yīng)液，并將中間體轉(zhuǎn)移至SEP-PAK C18柱，用5 mL丙酮分兩次把中間體洗脫至2號(hào)反應(yīng)管，加熱除丙酮至殘余0.1 mL，加入0.5 mL 57%的HI，160 ℃加熱水解10 min，冷卻后加入4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，混合液轉(zhuǎn)至中轉(zhuǎn)瓶，利用HPLC分離純化，分離柱為Grace Alltima C18(10 mm×250 mm)，流動(dòng)相為0.1%乙酸水溶液(含1 g/L抗壞血酸)，流速為4 mL/min，產(chǎn)品放射性峰收集后直接通過除菌濾膜得到最終產(chǎn)品。

圖1 親核法合成18F-DOPA示意圖Fig.1 Nucleophilic synthesis of 18F-DOPA

2.2 18F-DOPA的質(zhì)量控制

觀察產(chǎn)品顏色及澄清度；利用精密pH試紙測(cè)量酸堿度；利用分析型HPLC測(cè)量放化純度(分析柱為phenomenex luna C18 5 u(4.6 mm×150 mm)，紫外波長(zhǎng)為254 nm，流動(dòng)相為0.1%乙酸水溶液，流速為1 mL/min)，再與標(biāo)準(zhǔn)品共進(jìn)樣鑒定產(chǎn)品；碘鉑酸薄層檢測(cè)產(chǎn)品中K2.2.2含量；氣相色譜分析產(chǎn)品有機(jī)溶劑殘留；便攜式內(nèi)毒素檢測(cè)儀測(cè)量?jī)?nèi)毒素含量；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測(cè)量產(chǎn)品中銅離子含量。

2.3 18F-DOPA體外穩(wěn)定性

取三份18F-DOPA溶液并分別稀釋至370 GBq/L，第一份不添加任何試劑，即原液①，第二份中加入乙醇，配成乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%的溶液②，第三份中加入VC，配成VC10 mg/mL的溶液③。用分析型HPLC(2487紫外檢測(cè)器， BioScan流動(dòng)放射性檢測(cè)器)分別測(cè)定①、②、③于1、3、5 h的放化純度，比較加入乙醇、VC和原液穩(wěn)定性的不同。

2.4 藥物異常毒性實(shí)驗(yàn)

取NIH小鼠5只，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL 10 mCi/mL的18F-DOPA注射液，正常飼養(yǎng)，48 h觀察是否正常。

2.5 臨床PET/CT顯像

正常對(duì)照人僅用18F-DOPA顯像一次，而胰島細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者采用18F-FDG和18F-DOPA分別顯像，中間間隔48 h。 顯像方法如下：顯像人員按體質(zhì)量靜脈注射4.07 MBq/kg18F-DOPA，安靜環(huán)境下休息60 min后行全身PET/CT掃描，掃描范圍從頭部至股骨，PET圖像采用三維采集模式采集。利用CT數(shù)據(jù)對(duì)PET圖像進(jìn)行衰減校正，PET圖像重建采用OSEM法，CT重建采用標(biāo)準(zhǔn)重建法。對(duì)于胰島細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者，以ROI技術(shù)勾畫腫瘤區(qū)域并計(jì)算SUVmax。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-DOPA的自動(dòng)化合成

圖2 HPLC分離產(chǎn)品的放射性色譜圖Fig.2 Radioactivity chromatograms of HPLC separation products

利用新型標(biāo)記前體6-硼酯-二甲氧基-L-DOPA，在國(guó)產(chǎn)雙管氟多功能模塊自動(dòng)化合成18F-DOPA，在制備HPLC上收集約7 min 時(shí)唯一放射性峰(圖2)，由于流動(dòng)相中加入了抗壞血酸，干擾了紫外吸收，無(wú)法檢測(cè)紫外吸收峰。從氟-18離子到最終產(chǎn)品，合成耗時(shí)約為60 min，不校正合成效率為(10.0±2.3)%(n=6)，單次產(chǎn)量大于7.4 GBq，合成穩(wěn)定性和可靠性高。連續(xù)成功合成14次。

間接親核合成18F-DOPA的效率較高，大于30%，除合成步驟多、準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)外，還需采用手性催化劑，合成后需要鑒別D-DOPA的含量[6]。而直接親核反應(yīng)合成18F-DOPA步驟少，方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)品為無(wú)載體，且前體為手性化合物，親核和水解不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的手性有影響，是目前研究的熱點(diǎn)。Lee等[7]使用鎳絡(luò)合物類標(biāo)記前體在室溫下親核生成18F-6-氟-L-DOPA，制備時(shí)間短，條件溫和，但鎳絡(luò)合物前體合成較復(fù)雜，同時(shí)存在高價(jià)碘氧化劑；Hoepping[8]使用含有硝基的標(biāo)記前體，通過親核取代、Baeyer-Villiger、酸水解三步反應(yīng)一鍋法制得18F-DOPA，水解只需6 mol/L的鹽酸，條件溫和，放化產(chǎn)率較高；芳基碘翁鹽類標(biāo)記前體可進(jìn)行配體交換形成氟化碘鎓，熱分解后生成氟化物，Kuik等[9]利用二芳基碘鎓鹽為前體制備18F-DOPA，得到比活度高的產(chǎn)品，但合成時(shí)間需要2 h；Tredwell等[5]以芳基硼酸酯為前體，以Cu(OTf)2(py)4為催化劑親核取代制得18F-DOPA，該前體穩(wěn)定易得，催化劑Cu(OTf)2(py)4已商品化，產(chǎn)品放化純度和光學(xué)純度都比較高，但需使用銅鹽作催化劑，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆椒ǔャ~鹽，保證產(chǎn)品中銅離子濃度在合格范圍。本研究采用雙BOC保護(hù)氨基的前體，在銅鹽催化下，18F取代硼酯，在國(guó)產(chǎn)多功能模塊上經(jīng)親核、水解和HPLC純化，自動(dòng)化得到可供注射的18F-DOPA。該方法的優(yōu)點(diǎn)是合成前準(zhǔn)備時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)單，合成效率較合適。

3.2 18F-DOPA的質(zhì)量控制

產(chǎn)品為無(wú)色透明溶液，pH為6～7；放化純度大于99%，樣品放射性峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收峰保留時(shí)間一致(圖3)；三批注射液樣品中K2.2.2含量低于50 μg/mL(碘鉑酸薄層未顯色)；乙腈、丙酮含量均低于0.04%w/w，內(nèi)毒素低于5 Eu/mL；連續(xù)三批產(chǎn)品中銅離子含量分別為：1.05×10-6、0.50×10-6和1.07×10-6，低于藥典規(guī)定的注射劑中銅離子濃度25×10-6 [10]。本方法的質(zhì)控關(guān)鍵點(diǎn)為銅離子含量，為了除去銅鹽，在產(chǎn)品親核取代后將半成品通過SEP-PAK C18柱純化，用大量水沖洗C18柱，最后用丙酮將酯溶性的產(chǎn)品從C18柱上淋洗到第二反應(yīng)管再水解；最終產(chǎn)品經(jīng)半制備HPLC純化。對(duì)比文獻(xiàn)合成該類二步法顯像劑時(shí)，由于采用一個(gè)反應(yīng)管的多功能模塊，一般將半成品轉(zhuǎn)移到C18柱后，再?gòu)暮线m的淋洗液將產(chǎn)品淋洗回到原反應(yīng)管；這種方法不但操作麻煩，而且不利于除銅離子。本研究的結(jié)果表明，雙反應(yīng)管可有效除去銅鹽。為了方便實(shí)時(shí)測(cè)量，對(duì)比了Bante321-Cu便攜式銅離子濃度計(jì)與ICP-AES的結(jié)果，基本一致，便攜式銅離子濃度計(jì)適于產(chǎn)品的自檢。

圖3 分析型HPLC譜圖Fig.3 HPLC spectrum of 6-18F-L-DOPA

3.3 18F-DOPA體外穩(wěn)定性

18F-DOPA原液放化純度為99.4%，室溫放置5 h后放化純度降為92.04%，臨床使用會(huì)造成骨顯像；加入VC或乙醇，5 h后放化純度為98.4%，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性(表1)。

18F-DOPA本身不穩(wěn)定，在含鹽溶液中會(huì)自行氧化成活性醌類繼而聚合成多巴色素，導(dǎo)致其放化純度降低，加之放射性射線產(chǎn)生的自由基，可加速左旋多巴制劑的分解[11-12]。文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在大劑量、 高濃度下18F-FDG也不穩(wěn)定，加入適量的穩(wěn)定劑乙醇可以提高其穩(wěn)定性[13]。本研究參考乙醇的作用，在產(chǎn)品中加入微量穩(wěn)定劑乙醇或還原劑VC，均可以提高18F-6-氟-L-DOPA的穩(wěn)定性。在實(shí)際操作中，因注射液中乙醇含量的限制，以加入VC更合適。

3.4 異常毒性實(shí)驗(yàn)

小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應(yīng)。

3.5 臨床初步應(yīng)用

L-DOPA是神經(jīng)遞質(zhì)DP的原料，18F-L-DOPA濃集于紋狀體，根據(jù)放射性的分布18F-DOPA在上世紀(jì)八十年代用于診斷帕金森病，但由于是代謝型顯像劑，靈敏度不及受體類顯像劑，近年來(lái)逐步被受體類顯像劑如：123I-FP-CIT或18F-FP-CIT等取代。但由于其特有的靶向性，本研究首先在正常人上證實(shí)顯像劑臨床效果。結(jié)果表明，示蹤劑特異性濃集于紋狀體，證明了其靶向性。全身顯像表明，放射性可濃集于膽囊，胰腺有一定的攝取，主要從泌尿系統(tǒng)排泄(圖4)。

表1 18F-DOPA體外穩(wěn)定性Table 1 Stability in vitro of 18F-DOPA

在胰島細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)患者18F-DOPA顯像表明，MR所示占位區(qū)(C)，有放射性濃集(圖5E,F)；而18F-FDG顯像則為陰性(圖5A,B)，最后再次手術(shù)證實(shí)，該占位為胰島細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)。

圖4 正常男志愿者注射示蹤劑60 min后顯像Fig.4 Set of images of a 52 years old normal male volunteers

4 小結(jié)

本研究采用國(guó)產(chǎn)氟多功能模塊，經(jīng)改進(jìn)雙管法合成工藝，可簡(jiǎn)單、快速合成18F-DOPA，對(duì)推動(dòng)國(guó)內(nèi)18F -DOPA在臨床上的應(yīng)用具有較大的意義。