腫瘤PET分子探針3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴的合成及初步生物學(xué)評(píng)價(jià)

馬晶鑫，伍 洲，姜申德，王紅亮,3，武志芳,3

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，山西 太原 030001；2.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.山西省分子影像精準(zhǔn)診療協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太原 030001)

18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose,18F-FDG)是目前正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography, PET)常用的一種糖代謝型顯像劑，但存在特異性差、腦腫瘤檢出率低、腫瘤與炎癥的鑒別診斷假陽(yáng)性或假陰性等問(wèn)題[1-2]。氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑是18F-FDG在臨床腫瘤PET顯像應(yīng)用中的重要補(bǔ)充[3]。O-(2-18F-氟代乙基)-L-酪氨酸(18F-FET)是目前臨床上常用的腦腫瘤PET顯像劑[4-5]。6-18F-氟-L-多巴(18F-FDOPA)是腦腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的較理想顯像劑，經(jīng)過(guò)方法改進(jìn)、新型標(biāo)記前體的研發(fā)及手性相轉(zhuǎn)移催化法的應(yīng)用，18F-FDOPA的合成越來(lái)越簡(jiǎn)單，但仍存在合成時(shí)間長(zhǎng)、前體制備復(fù)雜、副產(chǎn)物多、對(duì)設(shè)備條件要求較高等諸多問(wèn)題[6]。因此，本研究以多巴為原料，向其芳香環(huán)上直接引入帶有易離去基團(tuán)的碳鏈，采用同18F-FET類似的親核取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)18F標(biāo)記，合成一種新型18F標(biāo)記的多巴衍生物3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴(3-O-(2-18F-fluoroethyl)-L-DOPA,18F-FEDOPA)。并通過(guò)體內(nèi)生物分布及腫瘤PET顯像評(píng)價(jià)其作為一種新型的氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

回旋加速器(HM-10型)：日本住友公司產(chǎn)品；Micro-PET/CT掃描儀(IRIS, Inviscan)：法國(guó)Inviscan公司產(chǎn)品；核磁共振波譜儀(AV300 MHz)：德國(guó)Bruker公司產(chǎn)品；高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)(Series Ⅲ型，Lab Alliance)：美國(guó)Lab Alliance公司產(chǎn)品，配有B-FC-3600型高能放射性檢測(cè)器(美國(guó)Bioscan公司產(chǎn)品)和201型紫外檢測(cè)儀(美國(guó)Lab Alliance公司產(chǎn)品)；C18分析型色譜柱(5 μm, 250 mm×4.6 mm)：英國(guó)GRACE/Hichrom公司產(chǎn)品；C18半制備型色譜柱(5 μm, 250 mm×10 mm)：日本YMC公司產(chǎn)品；全自動(dòng)雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器(SN-697型)：上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品；Sep Pak QMA小柱：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

4，7，13，16，21，24-六氧-二氮雙環(huán)[8.8.8]二十六烷(Kryptofix 2.2.2，K2.2.2)：法國(guó)ABX公司產(chǎn)品；無(wú)水乙腈(CH3CN)、無(wú)水碳酸鉀(K2CO3)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子純化水；瘤株：纖維肉瘤(S180)和肝癌(H22)細(xì)胞株：購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康美國(guó)癌癥研究所(institute of cancer research, ICR)小白鼠25只，雌雄不限，20～25 g，清潔級(jí)，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(晉)2015-0001。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1HPLC色譜條件 分析：C18分析型色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B)的混合液(體積比為1∶9)，流速為1 mL/min，紫外(UV)波長(zhǎng)為254 nm。分離純化：C18半制備型色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)+水(B)混合液，流速為3 mL/min，流動(dòng)相中乙腈(A)的梯度條件為0～1 min：10%；1～20 min：10%～80%；20～25 min：80%～10%。

1.4.21H NMR條件 以氘代氯仿(CDCl3)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 前體化合物合成

前體化合物的合成路線示于圖1。以L-多巴(L-DOPA)為原料，在甲醇及氯化亞砜參與下發(fā)生甲酯化反應(yīng)，得到化合物2(L-DOPA甲酯)；在四氫呋喃(THF)中，使用2.1倍當(dāng)量的二碳酸二叔丁酯(Boc2O)對(duì)化合物2的α-氨基和4-羥基進(jìn)行保護(hù)，得到化合物3；將化合物3加入丙酮溶劑中，由K2CO3和18-冠-6共同催化，與乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯反應(yīng)，得到前體化合物4(N-叔丁氧羰基-(3-O-甲苯磺酸酯乙基-4-O-叔丁氧羰基)-L-多巴甲酯)。另外，為了獲取參比化合物3-O-(2-[19F]氟乙基)-L-多巴([19F]FEDOPA)，在K2CO3和18-冠-6共同催化下，化合物3在丙酮溶劑中與2-氟代乙醇對(duì)甲苯磺酸酯反應(yīng)，得到未脫BOC保護(hù)的參比化合物5。

2.2 18F-FEDOPA的放化合成

18F-FEDOPA的合成路線示于圖2。1) 加速器產(chǎn)出的18F-經(jīng)Sep Pak QMA柱捕獲，用1.5 mL K2.2.2/K2CO3水溶液將18F-洗脫至反應(yīng)瓶中。2) 110 ℃下通入氮?dú)?，吹干，加? mL CH3CN再次共沸蒸干。3) 向反應(yīng)瓶?jī)?nèi)加入8～9 mg前體化合物4(1 mL CH3CN溶解)，110 ℃油浴中密封反應(yīng)15 min。4) 反應(yīng)結(jié)束后使用半制備型HPLC分離純化，收集放射性保留時(shí)間tR=12.5 min的產(chǎn)品至蒸餾瓶。5) 將收集的溶液于40 ℃下旋蒸除去溶劑后，加入4 mol/L HCl水溶液(0.3 mL)，110 ℃下密封加熱20 min后，使用0.6 mL 2 mol/L NaOH水溶液中和，加入注射用水稀釋后過(guò)濾膜待用。

圖1 18F-FEDOPA前體化合物的合成路線Fig.1 Synthesis of the precursors of 18F-FEDOPA

圖2 18F-FEDOPA的放化合成Fig.2 Synthesis of 18F-FEDOPA

2.3 質(zhì)量控制及體外穩(wěn)定性檢測(cè)

2.3.1質(zhì)量控制 用精密pH試紙測(cè)定18F-FEDOPA注射液的pH。用帶有放射性檢測(cè)器的分析型HPLC測(cè)定化合物5、18F--洗脫液、18F-5以及18F-FEDOPA的保留時(shí)間和放化純度。

2.3.2體外穩(wěn)定性檢測(cè) 將18F-FEDOPA溶液室溫靜置，于標(biāo)記后0、60、120、240 min按上述HPLC分析條件測(cè)定放化純度。

2.4 體內(nèi)生物分布

健康ICR小鼠4組，每組3只，腹腔注射0.2 mL的3.6%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。尾靜脈注射18F-FEDOPA(0.2 mL，1.85 MBq)。注射后于10、30、60、90 min時(shí)，眼靜脈取血后斷頸處死，解剖取心、腦、肝、腎、肺、腸、肌肉及骨等組織臟器，分別測(cè)定各組織的質(zhì)量與放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織衰減校正后的百分注射劑量率(%ID/g)。

2.5 腫瘤模型制備

將H22肝癌細(xì)胞和S180肉瘤細(xì)胞株用滅菌生理鹽水配制成1×107mL的濃度, 接種于正常ICR小鼠腹腔，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，1周后待其腹腔充盈后抽取腹水待用。取ICR小鼠若干只，在其肢體左、右側(cè)皮下同時(shí)分別植入H22和S180小鼠肉瘤腹水(0.2 mL，腫瘤細(xì)胞數(shù)約6(105mL)，1周后待腫瘤生長(zhǎng)至直徑約0.8～1.0 cm時(shí)使用。

2.6 PET/CT顯像

荷H22、S180腫瘤ICR小鼠3組，每組3只，腹腔注射0.2 mL的3.6%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉。第一組經(jīng)尾靜脈注射18F-FEDOPA(0.2 mL，3.7 MBq)后立即行PET動(dòng)態(tài)掃描，總采集時(shí)間90 min。圖像預(yù)處理：將每10 min采集的數(shù)據(jù)分割為一幀，共9幀。圖像重建采用基于蒙特卡羅系統(tǒng)模型的3D OSEM(ordered subsets expectation maximization)算法。先行PET采集后再行CT掃描。CT圖像重建采用Feldkamp濾波反投影算法，并執(zhí)行射束硬化校正及環(huán)形偽影校正。圖像分析采用PMOD軟件(PMOD Technologies LLC, Zurich, Switzerland)進(jìn)行，勾畫(huà)出腫瘤、心臟、腦、肌肉等感興趣區(qū)域 (volume of interest, VOI)，并導(dǎo)出時(shí)間活度曲線(time-activity curve, TAC)。第二、三組小鼠分別注射18F-FDG(0.2 mL，3.7 MBq)和18F-FEDOPA(0.2 mL，3.7 MBq)，于注射60 min后均行10 min的PET靜態(tài)掃描和CT掃描，并進(jìn)行圖像重建以及對(duì)各感興趣組織的定量分析，確定每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)，并計(jì)算腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比(T/NT)。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)合成

參照18F-FET合成方法，設(shè)計(jì)合成了18F-FEDOPA新的前體化合物4。在L-多巴分子苯環(huán)的3-羥基處引入一個(gè)帶有易離去基團(tuán)的碳鏈，既便于通過(guò)親核反應(yīng)實(shí)現(xiàn)18F標(biāo)記，又能有效保留多巴分子的α氨基和羧基的完整結(jié)構(gòu)。

18F-FEDOPA前體化合物4以L-多巴為原料，制備過(guò)程均為常見(jiàn)化學(xué)反應(yīng)：化合物2制備為常規(guī)酸催化甲酯化反應(yīng)；化合物3的制備根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)中的α-氨基，以及苯環(huán)上3和4-羥基的反應(yīng)活性的不同，使用適量的二碳酸二叔丁酯為保護(hù)試劑，得到了叔丁氧羰基對(duì)α-氨基和苯環(huán)上4-羥基選擇性保護(hù)的化合物3；前體化合物4的合成在堿性條件下使用乙二醇二對(duì)甲苯磺酸酯對(duì)3-OH烷基醚化的反應(yīng)。另外，為便于對(duì)18F-FEDOPA的放化合成過(guò)程進(jìn)行有效監(jiān)控及產(chǎn)品確認(rèn)，使用了制備化合物4相同的條件，由化合物3與化合物2-氟代乙醇對(duì)甲苯磺酸酯經(jīng)醚化反應(yīng)，得到18F-FEDOPA未經(jīng)脫出BOC保護(hù)的參比化合物5?；衔?、4、5經(jīng)核磁鑒定后，確定了結(jié)構(gòu)的正確性。

化合物3：淡黃色油狀物(8.02 g,76.2%)，1H NMR(CDCl3):1.424(s,9H,N-Boc-CH3),1.556(s,9H,O-Boc-CH3),3.013-3.026(m,2H,DOPA-CH2),3.707(s,3H,OCH3),4.542-4.557(m,1H,DOPA-CH),5.021(d,J=7.9 Hz,1H, DOPA-NH),6.654(d,J=8.2 Hz,1H,6-ArH),6.776(d(br),1H,2-ArH),7.083(d,J=8.2 Hz,1H,5-ArH)。

化合物5：黃色油狀液體(0.43 g,76.7%)，產(chǎn)率76.7 %;1H NMR(CDCl3):1.423(s,9H,N-Boc-CH3),1.548(s,9H,O-Boc-CH3),3.060(dq,J=6.1 Hz,J=14 Hz,2H,DOPA-CH2),3.711(s,3H,OCH3),4.235-4.276(m,2H,CH2-O-Ar),4.580(dd,J=6.3 Hz,J=13.7 Hz,1H,DOPA-CH),4.714(d,AA′BB′,J=48 Hz,2H,CH2-F),4.982(d,J=8.0 Hz,1H,DOPA-NH),6.725-6.756(m,2H,ArH),7.050(d,J=8.1 Hz,1H,5-ArH)。

3.2 18F-FEDOPA的制備

3.3 質(zhì)量控制

圖3 放射性(a、b、d)和紫外(c)HPLC圖譜Fig.3 Radioactivity (a, b, d) and UV (c) HPLC chromatograms

前體化合物4經(jīng)18F-氟化反應(yīng)后進(jìn)行Radio-HPLC分析(圖3a)：18F-的保留時(shí)間為2.8 min，18F-5的保留時(shí)間為14.3 min；經(jīng)半制備柱HPLC分離純化后，將18F-5與化合物5同時(shí)經(jīng)Radio(圖3b)-UV(圖3c)HPLC分析顯示，兩者保留時(shí)間均為14.3 min，證明18F-5結(jié)構(gòu)的正確性。然后經(jīng)4 mol/L HCl加熱后得到目標(biāo)產(chǎn)品18F-FEDOPA，Radio-HPLC保留時(shí)間為4.5 min(圖3d)，放化純度為99%。分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，產(chǎn)品在HPLC中的保留時(shí)間較長(zhǎng)，中和至中性到弱堿性，產(chǎn)品保留時(shí)間則稍有前移(保留時(shí)間提前約0.5 min)?？赡茉趬A性條件下，18F-FEDOPA的羧基會(huì)以羧酸鹽的形式存在，分子結(jié)構(gòu)帶有負(fù)電荷，分子的極性增大，18F-FEDOPA在反相的C18柱上滯留性稍降低。在中性或酸性條件下，則是羧酸的形式，呈電中性，在C18柱上的滯留性較在堿性條件下滯留性增加。18F-FEDOPA注射液為無(wú)色澄清溶液，pH約6～7。室溫下0、60、120、240 min的放化純度分別為：98.65%、98.58%、97.98%、97.49%，4 h內(nèi)放化純度沒(méi)有明顯降低，均大于95%，表明其穩(wěn)定性良好。

3.4 體內(nèi)生物分布

圖4 18F-FEDOPA的健康小鼠體內(nèi)生物分布Fig.4 The biodistribution in healthy mice of 18F-FEDOPA

18F-FEDOPA在健康小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果示于圖4。由圖4結(jié)果可見(jiàn)，18F-FEDOPA主要通過(guò)腎臟代謝，注射后10、30、60、90 min時(shí)的腎臟放射性攝取率分別為(4.50±0.54)、(3.62±0.53)、(2.76±0.36)、(1.33±0.25)%ID/g。血液放射性隨時(shí)間增加逐漸降低，90 min時(shí)即降至(0.50±0.09)%ID/g。骨骼的攝取值無(wú)明顯增加，說(shuō)明其在體內(nèi)未發(fā)生脫氟，體內(nèi)穩(wěn)定性良好。心臟和腦組織的放射性攝取明顯低于其他組織，且隨時(shí)間增加未見(jiàn)明顯增大，60 min時(shí)的攝取值分別為(1.01±0.18)、(0.90±0.24)%ID/g，與大部分氨基酸顯像劑的分布特性相似，具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性[7-9]。

3.5 PET/CT顯像

本研究成功制備了S180纖維肉瘤-H22肝癌一體模型，并完成了18F-FEDOPA 90 min動(dòng)態(tài)PET/CT顯像。注射18F-FEDOPA 10 min后即出現(xiàn)腫瘤顯影，隨時(shí)間增加，體內(nèi)放射性迅速清除，腫瘤顯示更加明顯。TAC曲線示于圖5，H22和S180腫瘤均有較明顯的顯像劑攝取，且10 min后H22相對(duì)較高。腫瘤攝取值隨時(shí)間逐漸增加，60 min時(shí)達(dá)到峰值：H22為(6.375±1.025) %ID/g，S180為(5.152±0.853) %ID/g，90 min時(shí)仍有明顯蓄積。心臟、腎臟內(nèi)放射性清除較快，其余臟器攝取值均不高，腦組織最低，且隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化，與生物分布結(jié)果一致。

圖5 18F-FEDOPA在腫瘤及臟器中的時(shí)間-放射性攝取率曲線Fig.5 Time activity curves of 18F-FEDOPA in tumors and organs

荷瘤小鼠分別注射18F-FEDOPA和18F-FDG 60 min時(shí)的PET/CT融合圖像示于圖6。由圖6結(jié)果可見(jiàn)，腫瘤組織清晰顯影，與18F-FDG相比，18F-FEDOPA的本底整體明顯較低(以腦和心臟部位為著)，腫瘤顯影更加清晰。18F-FEDOPA和18F-FDG在注射60 min時(shí)動(dòng)物腫瘤與非腫瘤組織的放射性攝取比(T/NT)結(jié)果示于圖7，18F-FEDOPA的腫瘤與心、腦的比值較18F-FDG高(H22/腦：7.73±2.10>2.14±0.71，S180/腦：4.62±1.52>2.14±0.71；H22/心：4.33±1.22>1.89±0.25，S180/心：2.59±0.30>1.56±0.30，P<0.05)，腫瘤與肌肉比值無(wú)明顯差異。18F-FEDOPA作為一種多巴衍生物仍屬小分子氨基酸化合物，能夠通過(guò)血腦屏障。然而正常腦組織獲取能量最主要的物質(zhì)是葡萄糖[10]，與18F-FDG相比，多種氨基酸類顯像劑在腦組織中的攝取較低，在腦腫瘤顯像方面更具優(yōu)勢(shì)[11-12]。鑒于本研究中18F-FEDOPA較低的腦攝取和較高的腫瘤與腦的比值，18F-FEDOPA在腦腫瘤顯像方面可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

a——注射18F-FEDOPA 60 min時(shí)S180(左)和H22(右)的PET/CT融合圖像b——注射18F-FDG 60 min時(shí)S180(左)和H22(右)的PET/CT融合圖像圖6 荷瘤小鼠microPET/CT顯像a——PET/CT imaging of S180 (left) and H22 (right) at 60 min post-injection of 18F-FEDOPA b——PET/CT imaging of S180 (left) and H22 (right) at 60 min post-injection of 18F-FDGFig.6 microPET/CT imaging of S180-H22 tumor-bearing mice

圖7 注射18F-FEDOPA和18F-FDG 60 min時(shí)的腫瘤與非腫瘤組織放射性攝取比(T/NT)Fig.7 The tumor to normal tissue ratio (T/NT) at 60min post-injection of 18F-FEDOPA and 18F-FDG

與18F-FDOPA在黑色素瘤小鼠模型體內(nèi)的分布結(jié)果相比[13]，模型小鼠注射18F-FEDOPA 60 min后的正常組織整體攝取值高于18F-FDOPA，但腫瘤與心、腦的T/NT都較高，提示18F-FEDOPA具備18F-FDOPA類似的診斷效能。相比于18F-FET在結(jié)腸癌小鼠的分布結(jié)果[14]：模型小鼠注射18F-FEDOPA 60 min后的生物分布特點(diǎn)與18F-FET相似，大部分臟器的攝取值均偏低，以心臟和腦為著，提示18F-FEDOPA整體本底更低，更有助于腫瘤顯示。綜合分析，與18F-FDOPA和18F-FET相似，作為氨基酸的一種衍生物，18F-FEDOPA有良好藥代動(dòng)力學(xué)特征，且在腫瘤PET顯像方面具有很大潛能。

4 結(jié)論

本研究使用新型前體化合物N-叔丁氧羰基-(3-O-甲苯磺酸酯乙基-4-O-叔丁氧羰基)-L-多巴甲酯，經(jīng)兩步法成功標(biāo)記合成了3-O-(2-18F-氟乙基)-L-多巴(18F-FEDOPA)，其結(jié)構(gòu)與18F-FDOPA和18F-FET類似，合成過(guò)程簡(jiǎn)單，放化產(chǎn)率高，穩(wěn)定性良好。通過(guò)健康小鼠體內(nèi)生物分布實(shí)驗(yàn)及S180纖維肉瘤和H22肝癌模型小鼠的PET/CT顯像發(fā)現(xiàn)，18F-FEDOPA主要通過(guò)腎臟排泄，在兩種類型腫瘤組織中均有較高的攝取，而在心臟和腦組織的攝取較低。18F-FEDOPA有望成為一種新型的氨基酸代謝類腫瘤PET顯像劑，但其細(xì)胞攝取機(jī)制及代謝特征需要進(jìn)一步研究。