乙肝病毒X蛋白對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的影響及可能機(jī)制

李海燕 孫 靜 楊亞娟 張逍港

(西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710000)

肝纖維化是肝臟組織在各種病因的損傷下發(fā)生的一種可逆的損傷修復(fù)反應(yīng)，以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為特點(diǎn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)是ECM的主要來源。若肝纖維化得不到有效控制，最終會(huì)進(jìn)展為肝硬化。在我國(guó)，乙肝病毒(HBV)感染是導(dǎo)致肝炎、肝硬化的主要病因。研究表明〔1，2〕，HBV編碼的X(HBx)蛋白在肝纖維化的啟動(dòng)和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。NADPH 氧化酶(NOX)的多種亞基如NOX1、NOX2、NOX4，通過生成活性氧簇(ROS)介導(dǎo)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，在HSC活化中發(fā)揮了重要作用〔3～5〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1在各種類型的肝纖維化中，是最強(qiáng)的致纖維化的細(xì)胞因子。為證實(shí)HBx蛋白是否能夠活化HSC及通過何種分子活化HSC，本研究將HBx-pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入L02肝細(xì)胞株，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的L02-HBx細(xì)胞株，隨后制備L02-HBx、LX-2/L02-pcDNA3.1、 LX-2/L02的條件培養(yǎng)基，分別孵育HSC株LX-2。檢測(cè)HSC活化標(biāo)志物α-SMA、TGF-β1和NOX4的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步揭示其分子機(jī)制，探討HBx蛋白對(duì)HSC的活化和NOX分子表達(dá)的影響及TGF-β1在這個(gè)過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 人HSC株LX-2、人肝細(xì)胞株L02由中科院上海細(xì)胞庫提供；細(xì)胞孵育于培養(yǎng)基(由RPMI1640、10%小牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 kU/L青霉素配制而成)，放置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(37℃)，實(shí)驗(yàn)取用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒(西安依科生物有限公司)、NOX4 siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國(guó) Pierce公司)、潮霉素B、SB-431542(Sigma公司，美國(guó))、 TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó) Peprotech公司 )、兔抗人NOX4抗體，鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、α-tubulin抗體(美國(guó) Abcam公司)。

1.2HBx基因轉(zhuǎn)染L02細(xì)胞株 ①按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作步驟，將pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空pcDNA3.1質(zhì)粒。②轉(zhuǎn)染48 h，細(xì)胞以1∶10比例稀釋后，重新鋪24孔板。經(jīng)適當(dāng)濃度潮霉素B選擇培養(yǎng)2 w，種至96孔板。③挑取較大單克隆，消化后擴(kuò)大增殖至24孔板培養(yǎng)，最終擴(kuò)大至6孔板培養(yǎng)，直至可進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)，建立L02-HBx細(xì)胞株。

1.3ELISA檢測(cè)L02-HBx細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達(dá) 收集L02-HBx、L02-pcDNA3.1(陰性對(duì)照組)、L02細(xì)胞株(空白對(duì)照組)24 h的培養(yǎng)基，離心，吸取上清液，嚴(yán)格按照Peprotech公司TGF-β1 ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光值。

1.4制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白的肝細(xì)胞條件培養(yǎng)基 分別將三組細(xì)胞株以1×105密度接種于6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時(shí)更換為不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，48 h后吸取培養(yǎng)基，離心后取上清液即為條件培養(yǎng)基。

1.5Western印跡檢測(cè)條件培養(yǎng)基孵育的HSC中NOX4和α-SMA蛋白的表達(dá) 將LX-2細(xì)胞以1×105密度接種于6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合度時(shí)更換為不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，饑餓24 h。再以上述制備的L02-HBx條件培養(yǎng)基作用于饑餓后的LX-2細(xì)胞，陰性對(duì)照組為L(zhǎng)02-pcDNA3.1條件培養(yǎng)基，空白對(duì)照組為L(zhǎng)02條件培養(yǎng)基。處理24 h后，以含有1/100苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞，提取蛋白，并以BCA法定量。蛋白變性、上樣，行SDS-PAGE電泳，恒壓80 V，30 min后轉(zhuǎn)恒壓120 V 90 min，蛋白轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜75 min，封閉1 h，洗膜后分別與封閉液稀釋的特異一抗于4℃孵育過夜，PBST洗膜30 min，二抗孵育，室溫1 h，PBST洗20 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測(cè)NOX4敲減后HSC中α-SMA及NOX4蛋白表達(dá) 以NOX4 siRNA轉(zhuǎn)染 L02-HBx條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染介質(zhì)為L(zhǎng)ipofectamineTM2000脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑盒，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染無關(guān)siRNA序列，空白對(duì)照組不加干擾序列。轉(zhuǎn)染24 h后，提取上述3組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，方法同上。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.7Western印跡檢測(cè)加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達(dá) 將L02-HBx條件培養(yǎng)基分為3組，分別為：10 μmol/L SB-431542處理組，PBS處理組，未加處理組。將以上3組條件培養(yǎng)基孵育LX-2細(xì)胞24 h后，提取上述3組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行Western印跡檢測(cè)NOX4蛋白的表達(dá)，方法同上。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肝細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá) L02-HBx細(xì)胞中有相對(duì)分子質(zhì)量17 kD的條帶出現(xiàn)，而其余兩組細(xì)胞中無此條帶出現(xiàn)(圖1)，說明L02-HBx細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)HBx蛋白。

2.2L02-HBx細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達(dá) L02-HBx組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達(dá)量分別為(2 913.55±579.82)、(209.40±69.36)、(230.57±55.76)pg/ml，L02-HBx細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1的表達(dá)量顯著高于其他兩組(均P<0.01)。

2.3L02-HBx的條件培養(yǎng)基孵育HSC后，NOX4和α-SMA的蛋白表達(dá) 與L02-HBx共培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞(LX-2/L02-HBx)中NOX4(179.98±20.96)和α-SMA蛋白(180.27±18.05)表達(dá)均顯著高于陰性對(duì)照組(105.71±13.47，89.7±14.37)和空白對(duì)照組(111.8±24.82，93.66±18.42，P<0.01)，見圖2。

2.4敲減NOX4后HSC中α-SMA蛋白的表達(dá) LX-2/ L02-HBx+si-NOX4組中隨著NOX4表達(dá)(125.78±12.04)的下調(diào)，α-SMA的表達(dá)(121.81±33.89)也顯著低于陰性對(duì)照組(244.33±14.61，216.06±20.1)和空白對(duì)照組(242.04±25.28，221.46±27.34，P<0.05)，見圖3。

2.5在L02-HBx的條件培養(yǎng)基中加入TGF-β1受體抑制劑后NOX4蛋白的表達(dá) 加入SB-431542的L02-HBx的條件培養(yǎng)基，孵育過的LX-2中NOX4蛋白表達(dá)(53.04±9.39)顯著低于空白對(duì)照組(122.07±12.44，P<0.05)，見圖4。

1.L02-HBx;2.陰性對(duì)照組;3.空白對(duì)照組圖1 肝細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)

1.LX-2/L02-HBx;2.陰性對(duì)照組;3.空白對(duì)照組圖2 不同條件培養(yǎng)基孵育后，LX-2中NOX4和α-SMA蛋白的表達(dá)

1.LX-2/L02-HBx+si-NOX4;2.陰性對(duì)照組;3.空白對(duì)照組圖3 敲減NOX4后HSC中α-SMA和NOX4蛋白的表達(dá)

1.LX-2/L02-HBx+ SB-431542;2.空白對(duì)照組圖4 L02-HBx條件培養(yǎng)基中加入SB-431542后NOX4蛋白的表達(dá)

3 討 論

HBV感染是慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌的重要致病因素之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。HBx蛋白由HBV DNA中一個(gè)最小的開放閱讀框架編碼而成，由154個(gè)氨基酸組成，是一個(gè)多功能的調(diào)節(jié)因子。研究認(rèn)為HBx蛋白在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用〔6〕，如：它可以通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、干擾正常肝細(xì)胞修復(fù)、影響多種細(xì)胞信號(hào)通路等方式，從而調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。HSC是肝纖維化病理過程中ECM的主要細(xì)胞來源，它的活化在肝纖維化疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。目前，很多研究者致力于HBV導(dǎo)致肝纖維化機(jī)制的研究，結(jié)果表明〔7，8〕，HBV可以通過多種途徑啟動(dòng)HSC的活化，而HBx蛋白可以促進(jìn)其增殖并使其在肝纖維化的病理過程中發(fā)揮作用，但HBx活化HSC的具體機(jī)制尚未完全闡明。以往研究顯示〔9，10〕，NOX4在肝纖維化的大鼠模型中表達(dá)增加，尤其在HSC中的表達(dá)顯著高于對(duì)照。Lan等〔5〕揭示NOX4通過介導(dǎo)多條細(xì)胞信號(hào)通路，誘導(dǎo)HSC的持續(xù)激活。但NOX4在乙肝相關(guān)的肝纖維化中是否對(duì)HSC的活化發(fā)揮重要作用尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。TGF-β1是公認(rèn)的最強(qiáng)致纖維化的細(xì)胞因子，它誘導(dǎo)發(fā)生肝纖維化的主要機(jī)制有：促進(jìn)ECM的合成及抑制其降解、直接激活HSC、誘導(dǎo)肝細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞等〔11〕。但TGF-β1在乙肝相關(guān)的肝纖維化中是否調(diào)節(jié)NOX4的表達(dá)，進(jìn)而影響HSC的活化尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。為了更好地模擬人感染HBV后，肝細(xì)胞與HSC所發(fā)生的病理生理過程，本課題的研究對(duì)象區(qū)別于以往國(guó)內(nèi)外所使用的HepG2、 SMMC-7721等肝癌細(xì)胞株，以具有正常肝細(xì)胞形態(tài)功能的L02肝細(xì)胞株及人正常HSC株LX-2為研究對(duì)象，結(jié)果顯示L02-HBx細(xì)胞條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細(xì)胞中，α-SMA和NOX4的蛋白表達(dá)明顯增高，TGF-β1在L02-HBx細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的表達(dá)量也明顯增高。因此課題組做出如下假設(shè)：表達(dá)了HBx蛋白的肝細(xì)胞可以通過旁分泌TGF-β1的方式上調(diào)NOX4，NOX4進(jìn)一步促進(jìn)HSC的活化，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。

本研究利用si-NOX4干擾了L02-HBx條件培養(yǎng)基孵育的LX-2細(xì)胞后，檢測(cè)其表達(dá)及活化情況，結(jié)果表明隨著NOX4蛋白表達(dá)的下調(diào)，HSC活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)也部分地下調(diào)，這表明在乙肝相關(guān)的肝纖維化中，NOX4與α-SMA的表達(dá)具有一定的相關(guān)性，NOX4在HSC的活化中發(fā)揮了一定作用，在L02-HBx細(xì)胞條件培養(yǎng)基中加入TGF-β1的受體阻斷劑后，細(xì)胞中NOX4的表達(dá)顯著降低。本研究屬體外實(shí)驗(yàn)，故而其結(jié)論有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以驗(yàn)證。

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