Vaspin對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)聚集的影響

吳光秀 周澤華 孫建娟 唐 亮 熊 那 唐 亮 況小璐 肖 蓉

(重慶涪陵中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 408000)

脂肪組織不但是機(jī)體最主要的能量儲(chǔ)存器官，而且是重要的內(nèi)分泌組織，分泌多種細(xì)胞因子，在維持機(jī)體能量代謝平衡及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用〔1〕。Vaspin是內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑，是新近從一種2型糖尿病大鼠(OLETF rat)的內(nèi)臟白色脂肪組織中發(fā)現(xiàn)并分離的脂肪細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于脂肪、肝臟、胃、下丘腦等組織〔2～4〕。研究發(fā)現(xiàn)Vaspin與肥胖、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病(T2DM)及其并發(fā)癥等明顯相關(guān)〔5～10〕。Vaspin能夠提高小鼠基礎(chǔ)代謝率，抑制肝糖生成，改善胰島素抵抗，提高胰島素敏感性〔1,11〕。然而，Vaspin對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肝臟脂肪聚集的影響尚不完全清楚。本研究擬利用小鼠源性Vaspin重組蛋白，研究外源性Vaspin對(duì)高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪聚集的調(diào)節(jié)，以研究Vaspin生物學(xué)功能及其調(diào)節(jié)機(jī)體代謝的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 小鼠源性Vaspin蛋白購自瑞士Enzo公司；小鼠普通飼料購于第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料購于江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，其中普通飼料含脂肪19%，碳水化合物60%；高脂飼料含脂肪45%，碳水化合物35%。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)測(cè)定試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；胰島素測(cè)定試劑盒購自武漢優(yōu)而生生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光染料SyberGreen Ⅱ均購自Takara公司，各檢測(cè)基因引物均由上海Invitrogen公司合成；兔抗小鼠Vaspin單克隆抗體購自英國Abcam公司，兔抗小鼠β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自中杉金橋生物科技公司。

1.2模型構(gòu)建及樣本 健康雄性C57BL/6J小鼠48只，鼠齡7 w，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為普食組(NC)及高脂組(HC)，分別喂養(yǎng)16 w。于14 w末分別給予兩組腹腔注射生理鹽水(200 μl/只)或鼠源性Vaspin蛋白(劑量：2 mg/kg)，1次/d，共2 w；即NC組(普食+生理鹽水組)，NV組(普食+Vaspin組)，HC組(高脂+生理鹽水組)，HV組(高脂+Vaspin組)；各12只。喂養(yǎng)期間小鼠在籠中可以自由活動(dòng)，飲水和飼料均充足，每日晝夜周期為8 am～8 pm，室內(nèi)溫度保持(22±2)℃。

1.3肝組織提取與保存 小鼠斷頸處死，75%醫(yī)用酒精消毒手術(shù)區(qū)域3次，利用無菌剪刀剪開小鼠腹壁，暴露肝臟；更換無菌剪刀快速、輕柔離斷肝臟，利用預(yù)冷的無菌生理鹽水洗滌組織殘留血液，利用濾紙吸干殘留液體，用剪刀剝離附屬膽囊等組織后部分立即保存于液氮罐，部分直接保存于4%多聚甲醛液體。

1.4肝組織HE染色 4%中性多聚甲醛固定的肝臟標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片、二甲苯和系列梯度酒精脫水；之后利用蘇木精、伊紅染色。干燥后于普通顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5肝臟三酰甘油(TG)測(cè)定 測(cè)定試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，操作過程按照說明書通過酶法檢測(cè)組織總TG含量。

1.6基礎(chǔ)生化代謝指標(biāo)測(cè)定 小鼠禁食10 h后，摘除眼球取血至含有肝素抗凝劑的Eppendorf管中，離心后收集血漿樣本，-80℃保存待測(cè)?？崭寡遣捎闷咸烟茄趸阜y(cè)定；TG、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均用酶法測(cè)定；血漿胰島素采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。

1.7血漿Vaspin測(cè)定 空腹血漿Vaspin(武漢優(yōu)而生生物科技公司，編號(hào)：SEA706Mu)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)；測(cè)定過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，其中小鼠血漿采用試劑盒所提供樣品稀釋液進(jìn)行1∶4稀釋。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)基因mRNA表達(dá) 用Trizol法提取肝臟總RNA，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-PCR檢測(cè)各目的基因表達(dá)，利用2-△△Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各目的基因引物序列如下：β-actin:上游引物-5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′,下游引物-5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′； 肝臟乙酰輔酶A羧化酶(ACC):上游引物-5′AGCAGTTACACCACATACAT-3′,下游引物-5′GTCATCACCATCTTCATTACC-3′；脂肪酸合成酶(FAS):上游引物-5′CTCATCCACTCAGGTTCAG-3′,下游引物- 5′AGGTATGCTCGCTTCTCT-3′； 肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT)-1:上游引物-5′AGCCAGACGAAGAACATC-3′，下游引物- 5′CCTTGACCATAGCCATCC-3′； 激素敏感性脂肪酶(HSL):上游引物-5′AAGACCACATCGCCCACA-3′，下游引物-5′CTGAAGGCTCTGAGTTGCT-3′。

1.9肝臟組織Vaspin蛋白表達(dá)測(cè)定 利用蛋白裂解液放射免疫沉淀(RIPA)及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)等裂解肝臟，低溫12 000 r/min離心30 min。之后，吸取上清通過BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。取100 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉1 h后，依次加入稀釋的一抗、二抗反應(yīng)并洗脫，通過電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，以各目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1各組肝臟Vaspin表達(dá)水平變化 與NC組比較，HC組肝臟Vaspin mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)；NV組及 HV組肝臟Vaspin mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于NC組、HC組(P<0.01)。見圖1和表1。

圖1 各組肝臟組織Vaspin mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量

組別Vaspin mRNAVaspin蛋白NC組1.00±0.101.00±0.11NV組14.82±1.371)6.27±0.651)HC組4.91±0.421)3.68±0.381)HV組15.36±1.732)6.69±0.592)

與NC組相比:1)P<0.01;與HC組相比：2)P<0.01；表3同

2.2各組基礎(chǔ)代謝指標(biāo) 與NC組比較，HC組體重、FBG、TG、TC、FFA、LDL-C、FIns及血漿Vaspin水平明顯升高，而HDL-C水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。HV組體質(zhì)量、FBG、TG、TC、FIns、LDL-C和FFA明顯低于HC組；而HDL-C及血漿Vaspin濃度高于HC組(P<0.01)。見表2。

2.3各組肝臟脂肪聚集程度 HC組肝細(xì)胞脂質(zhì)空泡明顯形成，并伴大量炎癥細(xì)胞聚集；與HC組相比較，HV組肝臟脂質(zhì)空泡數(shù)量及相對(duì)面積均明顯減少。見圖2。

2.4各組肝臟脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因變化 與NC組比較，HC組ACC、FAS mRNA表達(dá)增高，而HSL、CPT-1明顯降低(P<0.01)，HV組ACC、FAS mRNA表達(dá)明顯低于HC組(P<0.01)， 而CPT-1、HSL表達(dá)水平明顯高于HC組(P<0.01)；NC組及NV組ACC、FAS、HSL及CPT-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組基礎(chǔ)生化指標(biāo)比較

與NC組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與HC組比較：3)P<0.01

圖2 各組小鼠肝臟脂質(zhì)聚集程度(×100)

組別ACCFASCPT-1HSLNC組1.00±0.091.00±0.101.00±0.121.00±0.10NV組1.02±0.111.09±0.980.97±0.091.12±0.12HC組3.96±0.401)4.03±0.481)0.61±0.091)0.50±0.061)HV組1.96±0.172)2.36±0.212)1.13±0.122)1.26±0.132)

3 討 論

Vaspin是2005年首次報(bào)道的一種主要由腹腔脂肪組織合成、分泌的絲氨酸蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一〔1〕。臨床研究表明肥胖、T2DM及胰島素抵抗人群血清中或內(nèi)臟脂肪組織中Vaspin水平較健康人群均明顯升高，而且升高幅度與糖脂代謝指標(biāo)、胰島素敏感性等相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)〔5～10,12〕。另外，近期的一些研究表明，不論是外周還是中樞 Vaspin蛋白或過表達(dá)載體輸注均可以降低鼠空腹血糖，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖鼠的食欲及肝糖生成，從而提高系統(tǒng)胰島素敏感性；然而，抑制或敲除Vaspin表達(dá)能夠進(jìn)一步加重高脂飲食喂養(yǎng)或基因誘導(dǎo)所致的糖代謝紊亂〔2,4,11,13〕。近來，國內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為胰島素抵抗是糖脂代謝等代謝紊亂性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，胰島素抵抗與肥胖緊密相關(guān)〔14〕。

過多的脂肪攝入是機(jī)體糖脂代謝紊亂的最主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。高脂喂養(yǎng)是目前誘導(dǎo)肥胖、高脂血癥及肝臟非酒精性脂肪性肝病的通用手段〔15〕。

本研究顯示，在高脂誘導(dǎo)肥胖及胰島素抵抗大鼠其內(nèi)在脂肪組織Vaspin 的 mRNA 及蛋白水平均明顯增高；其他多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)升高的血漿或組織Vaspin表達(dá)與肥胖、胰島素抵抗及T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且隨著胰島素敏感或肥胖程度的改善，Vaspin表達(dá)明顯降低甚至降至正常水平〔5～10〕。與此研究結(jié)果一致的是，本研究研究顯示高脂喂養(yǎng)16 w能夠明顯誘導(dǎo)血漿Vaspin水平及肝臟組織Vaspin的mRNA、蛋白表達(dá)。推斷Vaspin的表達(dá)升高可能是機(jī)體對(duì)高脂飲食所誘導(dǎo)的糖脂代謝負(fù)荷的代償性調(diào)節(jié)，在一定程度上有益于肥胖及胰島素抵抗的改善。

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)Vaspin 基因表達(dá)上調(diào)鼠能夠顯著提高肥胖小鼠的糖耐量水平，降低小鼠體重，調(diào)節(jié)胰島素作用信號(hào)通路〔2,11〕。與此相一致的是，本研究結(jié)果顯示Vaspin慢性持續(xù)輸注能夠明顯抑制高脂飲食喂養(yǎng)所誘導(dǎo)的肝臟脂肪細(xì)胞變性程度及肝臟TG含量蓄積。這進(jìn)一步有力說明了Vaspin對(duì)糖、脂代謝紊亂均有明顯的改善作用。然而，Vaspin輸注對(duì)普通飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟脂質(zhì)聚集無明顯影響，這可能是由于Vaspin發(fā)揮生理作用具有明顯的內(nèi)環(huán)境依賴性。

本研究結(jié)果表明Vaspin蛋白輸注能夠抑制高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)肝臟脂肪合成關(guān)鍵分子FAS、ACC的mRNA表達(dá)，而顯著促進(jìn)脂肪分解限制酶HSL、CPT-1的表達(dá)，然而，Vaspin蛋白輸注對(duì)普通飲食喂養(yǎng)組脂肪代謝關(guān)鍵分子的表達(dá)無明顯影響。因此，Vaspin可能通過抑制肝臟脂肪合成、促進(jìn)脂肪分解代謝而抑制肝臟脂肪蓄積，從而降低高脂飲食所誘導(dǎo)的體重增加。Vaspin基因表達(dá)增多可能通過中樞特定神經(jīng)核團(tuán)活性而調(diào)節(jié)肝糖生成即胰島素敏感性〔13〕，然而，對(duì)于Vaspin表達(dá)上調(diào)是間接通過中樞調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)聚集或直接調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝及Vaspin調(diào)節(jié)脂代謝的具體機(jī)制需要深入研究。

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