針刺對自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦室旁核炎癥因子含量及Toll樣受體4表達的影響

姬彩碩　馬思明　楊娜娜　田中雪　楊靜雯　邵佳凱　王雪蕊　劉存志

摘要：目的 觀察針刺對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）下丘腦室旁核（PVN）炎癥因子含量及Toll樣受體4（TLR4）表達的影響，探討其可能的作用機制。方法 10周齡SHR 30只，隨機分為SHR組、針刺組和非穴組，每組10只，另取同周齡WKY大鼠10只為正常組。針刺組針刺雙側“太沖”，采用捻轉瀉法刺激，非穴組針刺其足背側，采用平補平瀉捻轉法刺激，2周后取材。每日檢測1次大鼠平均動脈壓；RT-PCR檢測PVN中TLR4 mRNA的表達；Western blot檢測PVN中TLR4蛋白的表達；ELISA檢測PVN腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的含量。結果 與正常組比較，SHR組大鼠平均動脈壓升高，PVN中TLR4 mRNA和蛋白表達明顯升高，TNF-α、IL-6含量明顯增加（P<0.05）；與SHR組比較，針刺組大鼠平均動脈壓明顯下降，PVN中TLR4 mRNA和蛋白表達明顯降低，TNF-α、IL-6含量明顯減少（P<0.05）；而非穴組無明顯變化。結論 針刺“太沖”可能通過抑制SHR PVN中TLR4的表達，減少TNF-α、IL-6分泌，從而降低SHR血壓。

關鍵詞：針刺；太沖；高血壓；Toll樣受體4；炎癥因子；自發(fā)性高血壓大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.013

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0062-04

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on the level of inflammatory cytokines and toll-like receptor 4 in hypothalamic paraventricular nucleus （PVN） of SHR； To investigate the mechanisms of acupuncture in reduction of mean arterial blood pressure （MAP） in SHR. Methods Thirty 10-week old SHR were randomly divided into SHR group， acupuncture group and non-acupoint group， with 10 rats in each group. 10 WKY rats were set as control group. Acupuncture group received bilateral acupuncture in “Taichong” acupoint， and twisting and diarrhea method was used to stimulate； non-acupoint group received acupuncture at the back of feet， and soothing and diarrhea with twisting method was used to stimulate. Materials were taken two weeks later. The mean arterial pressure of rats was detected every day； the expression of TLR4 mRNA in PVN was detected by RT-PCR； The expression of TLR4 protein in PVN was detected by Western blot； The levels of TNF-αa nd IL-6 were detected. Results Compared with control group， the mean arterial pressure of SHR group increased； TLR4 mRNA and protein expression in PVN increased significantly； the level of TNF-α and IL-6 increased significantly （P<0.05）. Compared with SHR group， the mean arterial pressure of acupuncture group decreased significantly； TLR4 mRNA and protein expression in PVN decreased significantly； the level of TNF-α and IL-6 decreased significantly （P<0.05）. There was no significant change in non-acupoint group. Conclusion Acupuncture in “Taichong” acupoint can attenuate blood pressure of SHR by inhibiting expression of TLR4 in PVN and reducing the levels of TNF-α and IL-6.

Keywords： acupuncture； Taichong； high pressure； TLR4； inflammatory cytokines； spontaneously hypertensive rats

高血壓是一種常見的心腦血管疾病，具有病程長、發(fā)展較緩慢的特點。近年來研究表明，高血壓發(fā)生發(fā)展及其靶器官損害與慢性低量炎癥反應有關[1]。下丘腦室旁核（hypothalamic paraventricular nucleus，PVN）是腦內最重要的心血管調節(jié)中樞，在調節(jié)血壓中起著重要作用。有研究表明，腦內PVN中促炎因子的增加能夠促進高血壓的發(fā)生發(fā)展[2]。Toll樣受體家族（toll-like receptors，TLRs）是固有免疫中最主要的組成部分，是炎癥信號傳遞的重要蛋白，能夠啟動多種與炎癥反應相關的基因轉錄，導致炎癥介質的釋放，而Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是Toll樣受體家族中最主要的蛋白。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，針刺“太沖”能有效降低自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓[2]。本研究采用RT-PCR、Western blot及ELISA技術，觀察針刺“太沖”對SHR PVN中TLR4表達及炎癥因子含量的影響，旨在探討針刺降低血壓的可能機制。

1 實驗材料

1.1 動物

10周齡SPF級雄性SHR大鼠30只，WKY大鼠10只，體質量280～300 g，北京維通利華技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院基礎理論研究所SPF級動物實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（P3761，美國Sigma公司），Trizol試劑（美國Invitrogen Carlsbad公司），AMV反轉錄酶（美國Promega公司），ELISA試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），TLR4一抗抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），β-actin一抗（北京康為世紀生物科技有限公司），二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。電泳儀（北京六一儀器廠），Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR Biosciences公司），Bio-Rad iQ5定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），離心機（美國Beckman），華佗牌0.25 mm×13 mm一次性無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組

30只SHR大鼠隨機分為SHR組、針刺組和非穴組，每組10只。另取10只WKY大鼠作為正常組。

2.2 干預

適應環(huán)境后第2日進行干預。取雙側“太沖”[4]，行捻轉瀉法各30 s，留針10 min；非穴組大鼠選取其足背側第3、4跖骨結合部之前凹陷處作為對照刺激點，行平補平瀉捻轉手法各30 s，留針10 min。每日1次，治療6 d，休息1 d，2周共治療12次。正常組和模型組行與針刺組和非穴組相同時間、相同程度的捉抓刺激。

2.3 檢測指標

每日針刺后檢測大鼠血壓值。治療結束后第2日，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉。大鼠麻醉后斷頭快速取出腦組織，-80 ℃冰箱保存。

2.3.1 平均動脈壓測量

采用無創(chuàng)鼠尾動脈儀測量平均動脈壓。在安靜環(huán)境下，將大鼠放入限制其活動的固定器內，調節(jié)恒溫毯至37～38 ℃，用血壓感受器套住大鼠尾部近心端，調整鼠尾和壓力感受器接觸部位，調節(jié)儀器感知。設定大鼠血壓閾值（<190 mm Hg），待大鼠安靜、顯示器規(guī)律擺動時，按下開始鍵，儀器自動測量血壓，測壓結束后，記錄收縮壓、平均動脈壓及舒張壓。每只大鼠自動測量3次，取平均值。

2.3.2 炎癥因子測定

ELISA測定PVN中TNF-α、IL-6含量。嚴格按試劑盒說明書操作，用分光光度儀測定。

2.3.3 Toll樣受體4基因表達測定

RT-PCR測定PVN中TLR4基因表達。Trizol法提取各組細胞總RNA，按反轉錄試劑盒說明書操作，用熒光定量PCR擴增。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 5 min，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)，β-actin為內參。引物序列：TLR4上游5'-ACATCAAATGCCCCTACTCA-3'，下游5'-CT AAACCAGCCAGACCTTGA-3'（147 bp）；β-actin上游5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGC-3'，下游5'-GTTG AAGGTAGTTTCGTGGA-3'（106 bp）。

2.3.4 Toll樣受體4蛋白表達測定

Western blot測定PVN中TLR4蛋白表達。將下丘腦組織從腦中分離，常規(guī)勻漿提取總蛋白，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后，每組蛋白取20 μL上樣于10%SDS-PAGE膠，電泳2 h；用濕移法轉印到PVDF膜上，轉完后將膜用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；加入特異性的一抗（TLR4 1∶200），4 ℃孵育過夜；TBST液漂洗4次（5 min/次），加二抗（1∶5000），避光室溫孵育1 h，TBST液漂洗后，采用Odyssey近紅外雙色激光成像分析軟件處理，記錄每條蛋白電泳帶平均光密度值，進行定量分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較用方差分析，組間多重比較方差齊用Tukey法，方差不齊用Dunnett's T3。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 針刺對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響

與正常組比較，SHR組各時間點平均動脈壓均明顯升高（P<0.05）；與SHR組比較，針刺組各時間點平均動脈壓明顯降低（P<0.05）；與非穴組比較，針刺組各時間點平均動脈壓明顯降低（P<0.05）。結果見圖1。

4.2 針刺對自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦室旁核中炎癥因子的影響

與正常組比較，SHR組TNF-α、IL-6含量顯著增加（P<0.05）；與SHR組和非穴組比較，針刺組TNF-α、IL-6含量明顯減少（P<0.05）。結果見圖2、圖3。

4.3 針刺對自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦室旁核中Toll樣受體4表達的影響

與正常組比較，SHR組TLR4 mRNA和蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與SHR組和非穴組比較，針刺組TLR4 mRNA和蛋白表達明顯降低（P<0.05）。結果見圖4～圖6。

5 討論

中醫(yī)古代文獻并無高血壓病名，而現(xiàn)代醫(yī)家根據(jù)高血壓的臨床表現(xiàn)和病程演變，將其歸于“眩暈”“頭痛”范疇。對眩暈病癥的認識，中醫(yī)歷代醫(yī)家有不同的論述，認為眩暈屬肝所主，與髓海不足、血虛、邪中等多種因素有關?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈贰爸T風掉眩，皆屬于肝”，《證治匯補·卷之四》“以肝上連目系而應于風，故眩為肝風”。肝木旺，風氣甚，故頭目眩暈。有研究表明，針刺能降低高血壓患者治療期間24 h內收縮壓與舒張壓[5]，針刺高血壓動物模型能夠降低血壓、減少氧化應激損傷、降低炎癥反應[6-8]。太沖是肝經(jīng)原穴，是治療原發(fā)性高血壓的首選穴位。針刺太沖具有疏肝理氣、補益肝腎、平肝潛陽、理氣調血之功效。

SHR是國際上公認的最接近人類原發(fā)性高血壓的動物模型，能很好地復制高血壓生理病理過程。在心血管活動中起著重要的調節(jié)作用。炎癥反應在高血壓等心血管系統(tǒng)疾病的病理生理過程中普遍存在[9]。有研究表明，SHR PVN中促炎因子增加，可升高其平均動脈壓。TLR4是Toll樣受體家族中最明確參與高血壓發(fā)生發(fā)展的分子。Bomfim G F和DeBatista P R等[10-12]發(fā)現(xiàn)，在SHR和血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓模型中，TLR4能明顯促進內皮功能損傷，升高血壓。Dange R B等[2]發(fā)現(xiàn)，抑制下丘腦室旁核中TLR4表達能夠減少自主神經(jīng)功能障礙，減少炎癥因子的生成，從而使SHR血壓下降。

綜上所述，針刺可能抑制SHR PVN中TLR4的表達，減少炎癥因子的含量，從而降低血壓水平。提示針刺治療高血壓的作用機制可能與抑制TLR4通路、降低炎癥反應有關。

參考文獻：

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（收稿日期：2017-10-31）

（修回日期：2017-11-27；編輯：華強）