18α、18β-甘草酸單體抗酒精性肝損傷作用的比較研究

楊颯，孫曉可，孟祥波，趙紅紅，趙燕燕,2,3

（1.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002）（2.河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）（3.保定市食品藥品檢測(cè)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）

酒精性肝損傷是由于長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟損害[1]。長期大量的攝入酒精導(dǎo)致肝臟糖、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝功能紊亂[2]；同時(shí)產(chǎn)生大量的自由基，引起肝臟脂質(zhì)過氧化，使肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起肝細(xì)胞功能障礙[3]。酒精性肝損傷的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)[4,5]，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[6,7]，嚴(yán)重危害著人類健康，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前酒精性肝損傷的治療主要通過戒酒、營養(yǎng)支持以及藥物治療。常見的治療酒精性肝損傷藥物主要為糖皮質(zhì)激素、丙基硫氧嘧啶及谷胱甘肽等，但由于其較大的副作用，不能滿足臨床的需要。因此開發(fā)安全有效的治療酒精性肝損傷的藥物具有重要意義。天然藥物由于其安全性有效性受到了廣泛的關(guān)注。

甘草性味甘平，有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥之功，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣泛的藥物之一。甘草酸是甘草的主要活性成分，具有解毒、保肝、調(diào)節(jié)血脂、降血糖等藥理作用。甘草酸由于18位手性碳原子(C-18)構(gòu)型的不同，存在一對(duì)差向異構(gòu)體，即18α-甘草酸（18α-gly）和18β-甘草酸（18β-gly），二者的理化特性、藥理作用、不良反應(yīng)及臨床療效均存在顯著差異[8～10]。目前，18α-、18β-甘草酸是臨床上廣泛使用的治療各種肝臟疾病的藥物[11～13]，但是尚無二者治療酒精性肝損傷的療效對(duì)比的研究。因此，本研究使用18α-甘草酸及18β-甘草酸單體對(duì)酒精性肝損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)，從肝功能，物質(zhì)的代謝，非營養(yǎng)物質(zhì)的代謝及氧化應(yīng)激等多角度評(píng)價(jià)二者的藥效，比較18α-甘草酸及18β-甘草酸對(duì)酒精性肝損傷大鼠的治療作用，為指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)雄性SD大鼠，質(zhì)量（200±20）g，40只，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。于恒溫 25±2 ℃，恒濕45%±5%，各12 h明暗周期環(huán)境下飼養(yǎng)。提供全價(jià)顆粒飼料，自由進(jìn)食和飲水。

異甘草酸鎂注射液，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)（批號(hào)160125104，18α-甘草酸含量為 99.8%[14]）；注射用復(fù)方甘草酸單銨 S，山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)20151201，18β-甘草酸含量為 99.1%[14]）；無水乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司（批號(hào) 20160301）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20161018）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20161018）、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20161018）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20161018）、膽堿酯酶（CHE）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、膽固醇（TC）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、高密度脂蛋白（HDL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、低密度脂蛋白（LDL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928），總蛋白（TP）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928），白蛋白（ALB）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、球蛋白（GLO）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、總膽紅素（TBIL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）及膽汁酸（TBA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160928）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160927）、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160929）等生化試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備

7600Series全自動(dòng)生化檢測(cè)儀，日立建機(jī)株式會(huì)社；BSA224S萬分之一天平，德國賽多利斯集團(tuán)；H2518D離心機(jī)，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；MICRROM 手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)，美國 Thermo scientific公司；CM1860UV冰凍切片機(jī)，德國萊卡公司；顯微鏡，德國蔡司公司；Synergy HT全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國Bio-TEK儀器有限公司；MTN-2800W氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-88A水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MS-X漩渦混勻器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；制水機(jī)，成都浩康科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備

SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，即正常組，模型組，18α-甘草酸組，18β-甘草酸組。正常組按10 mL/kg給予生理鹽水，其余各組按10 mL/kg灌胃給予40%酒精。給藥組灌胃給予18α-Gly和18β-Gly，每天給藥一次，持續(xù)給藥4周。大鼠禁食12 h，麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4 ℃低溫3000 r/min離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存，備用。另取肝組織固定于10%甲醛溶液中，用于病理切片。

1.3.2 生化指標(biāo)的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、GGT、CHE、CK、LDH、TC、TG、HDL、LDL、TP、ALB、GLO、TBIL及TBA水平。取部分肝臟按照1:9比例加入生理鹽水，3000 r/min離心10 min，制備成 10%的肝勻漿。測(cè)定肝勻漿中超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

大鼠給藥4周后，進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。大鼠禁食不禁水12 h，灌胃給予50%葡萄糖（2.0 g/kg），給藥后0，15，30，60，90，120 min使用血糖儀檢測(cè)血糖。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制葡萄糖耐量曲線，并計(jì)算曲線下面積（AUC）。

1.3.4 病理學(xué)檢查

將固定于福爾馬林中的肝大葉，進(jìn)行石蠟包埋，切片，使用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較，p＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X±SD來表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠肝組織病理改變的影響

肝臟病理切片直觀的反映了肝細(xì)胞損傷程度。如圖1所示，正常組肝細(xì)胞無壞死變性，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊。模型組肝細(xì)胞腫脹變性，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，伴有脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤，表明大鼠的酒精性肝損傷模型造模成功。18α-甘草酸及18β-甘草酸組肝細(xì)胞變性及肝小葉結(jié)構(gòu)均有較大程度的改善，未見炎性細(xì)胞浸潤。18α-甘草酸組可見少量的脂滴，18β-甘草酸組未見脂滴。表明18α-甘草酸及18β-甘草酸在酒精性肝損傷方面均有較好的治療效果。其中，18β-甘草酸在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面有較好的效果。

2.2 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠肝功能影響

圖1 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠肝組織病理改變的影響（HE，×400）Fig.1 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the pathological changes of liver tissue in rats (HE, ×400)

ALT及AST是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞損害的指標(biāo)[15,16]。ALT存在于肝細(xì)胞胞漿中，肝細(xì)胞受損時(shí)導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加，血清中的ALT升高；AST存在于肝細(xì)胞線粒體中，血清中的AST升高，表明線粒體受損。同時(shí)ALP、GGT、CHE、CK及LDH為臨床上檢測(cè)肝損傷的常規(guī)指標(biāo)。與正常組相比，模型組大鼠血清中的ALT、AST、ALP、GGT、CHE、CK、LDH水平顯著升高（p＜0.01）。18α-甘草酸和18β-甘草酸能夠降低大鼠血清中的ALT、AST、ALP、GGT、CK、LDH水平，與模型組比較有顯著性差異（p＜0.01，p＜0.05）。此外，與模型組比較，18β-甘草酸顯著性降低大鼠血清中的 CHE 水平（p＜0.05）。表明 18α-甘草酸和 18β-甘草酸單體在改善肝功能方面均有較好效果（表1）。

表1 18α、18β-甘草酸單體對(duì)肝功能的影響Table 1 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the liver function in rats (n = 8, ±s)

表1 18α、18β-甘草酸單體對(duì)肝功能的影響Table 1 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the liver function in rats (n = 8, ±s)

注：與正常組比較：*p ＜0.05，**p ＜0.01；與模型組比較：#p＜0.05，##p＜0.01。

Groups ALT/(U/L) AST/(U/L) ALP/(U/L) GGT/(U/K) CHE/(KU/L) CK/(KU/L) LDH/(KU/L)正常組 47.40±1.41 168.52±17.01 114.47±4.92 1.70±0.10 0.20±0.05 1.87±0.08 1.63±0.26模型組 73.80±2.84** 198.25±16.85** 164.78±3.71** 2.55±0.07** 0.33±0.03** 2.70±0.43** 2.08±0.09**18α-甘草酸 58.35±4.31## 179.03±15.96# 139.50±9.76## 2.17±0.25# 0.29±0.03 2.12±0.39# 1.71±0.22#18β-甘草酸 50.83±4.52## 170.38±16.20## 147.24±7.93# 2.16±0.11## 0.25±0.05# 1.96±0.31# 1.63±0.13##

2.3 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的影響

圖2 18α、18β-甘草酸單體對(duì)糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的影響Fig.2 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the metabolism of glucose, lipid and protein in rats (n = 8,±s)

飲酒后，90%以上的酒精通過肝臟代謝，肝臟是代謝酒精的主要器官。乙醇代謝主要通過乙醇脫氫酶（ADH）和乙醇氧化酶系統(tǒng)（MEOS）介導(dǎo)[17]。酒精代謝過程中，消耗 NAD+生成過量 NADH，造成NADH/NAD+比例升高，影響了三羧酸循環(huán)，進(jìn)而影響葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝以及蛋白質(zhì)的合成[18,19]。OGTT試驗(yàn)用來檢測(cè)葡萄糖的代謝，TC、TG、HDL和LDL是評(píng)價(jià)脂質(zhì)代謝的指標(biāo)，TP、ALB、GLO反映了蛋白質(zhì)的合成。如圖a1-a2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的AUC增大，18β-甘草酸作用后AUC明顯降低（p＜0.01）。表明18β-甘草酸能顯著改善酒精引起的糖代謝紊亂。如圖b1-b4所示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的TG、TC水平升高，HDL水平降低（p＜0.01，p＜0.05）。

而18β-甘草酸能夠顯著降低TG、TC水平，升高HDL水平，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異（p＜0.01，p＜0.05）。此外，模型組大鼠的TP、ALB水平降低，GLO水平升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異（p＜0.05）。18α、18β-甘草酸均能夠顯著改善酒精引起的TP、ALB水平降低及GLO水平升高（p＜0.01，p＜0.05），見圖c1-c3。以上結(jié)果表明酒精能夠引起糖代謝，脂質(zhì)代謝，蛋白質(zhì)代謝紊亂，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。18α-甘草酸組大鼠的蛋白質(zhì)代謝得到改善；18β-甘草酸組大鼠的糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝均得到改善，提示18β-甘草酸在改善酒精性損傷大鼠的營養(yǎng)物質(zhì)代謝方面有較好的作用。

2.4 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠膽汁酸及膽紅素的影響

膽汁酸在肝臟中合成并分泌，反映肝細(xì)胞合成、攝取和分泌功能。同時(shí)肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的攝取、結(jié)合起著重要作用。肝細(xì)胞受損時(shí)，膽紅素代謝減少，膽汁酸攝取受阻，導(dǎo)致外周血中總膽汁酸升高[20]。如圖3所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中的TBIL、TBA水平顯著性升高（p＜0.01）。18β-甘草酸組大鼠血清中的TBIL、TBA水平均顯著性降低，與模型對(duì)照組相比有顯著性差異（p＜0.05），而18α-甘草酸組則無顯著性變化。

圖3 18α、18β-甘草酸單體對(duì)膽汁酸及膽紅素的影響（n=8，±s）Fig.3 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the TBA and TBIL in rats

這表明18α-甘草酸對(duì)膽汁酸以及膽紅素沒有調(diào)節(jié)作用，而18β-甘草酸在膽汁酸以及膽紅素的調(diào)節(jié)方面有較好效果。

2.5 18α、18β-甘草酸單體對(duì)大鼠抗氧化能力的影響

酒精代謝過程中產(chǎn)生大量的自由基，改變了細(xì)胞膜的通透性及流動(dòng)性，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，如MDA，并大量消耗抗氧化物質(zhì)，如SOD及GSH等。過多的自由基與抗氧化系統(tǒng)的失衡，最終造成氧化應(yīng)激，對(duì)肝臟造成損害[21]。

圖4 18α、18β-甘草酸單體對(duì)SOD、MDA、GSH水平的影響Fig.4 Effects of 18α-Gly and 18β-Gly on the levels of SOD,MDA and GSH in rats (n = 8,±s)

如圖4所示，與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織中的MDA水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低（p＜0.01，p＜0.05）。

與模型組比較，18α-甘草酸組及18β-甘草酸組大鼠肝臟組織中MDA水平顯著降低（p＜0.01）；同時(shí)，18β-甘草酸組的SOD、GSH水平顯著升高（p＜0.01，p＜0.05）。表明 18α-甘草酸及 18β-甘草酸單體均有較好的抗氧化作用，18β-甘草酸在調(diào)節(jié)SOD、GSH方面效果優(yōu)于18α-甘草酸。

3 結(jié)論

在本研究中，我們采用大鼠的酒精性肝損傷模型，研究了 18α、18β-甘草酸單體對(duì)酒精性肝損傷大鼠糖代謝、脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的改善作用。結(jié)果表明，18α-甘草酸及18β-甘草酸能夠改善酒精性肝損傷大鼠肝細(xì)胞腫脹變性，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤等病理損傷；兩者均能夠降低大鼠血清中的ALT、AST、ALP、GGT、CK、LDH水平，具有抗酒精性肝損傷的作用；18α-甘草酸能夠明顯改善酒精引起的蛋白質(zhì)代謝紊亂，18β-甘草酸對(duì)酒精引起的糖代謝、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝均有明顯的改善作用；18α-甘草酸及18β-甘草酸能夠顯著降低肝臟組織中的 MDA水平，此外，18β-甘草酸能夠顯著提高SOD及GSH的水平，兩者均能對(duì)抗酒精引起的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因此，18α-甘草酸和18β-甘草酸單體對(duì)酒精性肝損傷均有較好的保護(hù)作用，其中18β-甘草酸在調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝方面的作用優(yōu)于18α-甘草酸。造成二者藥理活性差距的原因可能是二者18-H構(gòu)象的不同。研究表明，18α-甘草酸為反式旋光異構(gòu)體，在體內(nèi)易與類固醇激素的靶細(xì)胞受體結(jié)合，其保護(hù)肝功、抗炎作用強(qiáng)于18β-甘草酸。而18β-甘草酸是順式旋光異構(gòu)體，具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)代謝的作用，在抑制脂質(zhì)的合成、促進(jìn)脂肪酸的氧化、抑制糖異生和促進(jìn)糖原的合成方面具有較強(qiáng)的藥理活性[23]。此外，這兩種異構(gòu)體的水解產(chǎn)物在藥代動(dòng)力學(xué)方面也存在著較為明顯的差異。這些都可能是造成18α-甘草酸和18β-甘草酸單體在肝損傷保護(hù)及糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)方面存在差異的原因，仍有待于深入研究。綜上，18α-甘草酸和18β-甘草酸單體對(duì)酒精性肝損傷具有較好的保護(hù)作用，其中18β-甘草酸在調(diào)節(jié)糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝方面有較好的作用，本研究將為指導(dǎo)臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。