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    基于NIR-SERS基底的肺癌氧合血紅蛋白NIR-SERS光譜研究

    2018-07-10 09:24:38朱紹玲
    關(guān)鍵詞:譜峰吡咯健康人

    高 飛,張 明,朱紹玲,熊 洋

    (1遵義醫(yī)學(xué)院物理教研室,貴州遵義562503;2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,貴州遵義562500;3楚雄師范學(xué)院光譜技術(shù)應(yīng)用研究所,云南 楚雄 675000)

    0 引言

    近些年來(lái),肺癌這種常見(jiàn)惡性腫瘤的死亡率以及發(fā)病率均迅速攀升,極大地威脅著各國(guó)人民的生命健康[1]。 數(shù)據(jù)[2]顯示,我國(guó)每年死于肺癌的人數(shù)高達(dá)60余萬(wàn),這種疾病的累計(jì)危險(xiǎn)性已經(jīng)迅速攀升至首位。一直以來(lái),醫(yī)學(xué)界均尚未探索出比較高效且完善的肺癌診斷治療方案,因此很難及時(shí)發(fā)現(xiàn)并診斷肺癌。這種情況直接導(dǎo)致了許多肺癌患者被誤診或病情延誤,往往在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至晚期。就現(xiàn)階段而言,支氣管鏡檢查、放射性核素檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、X射線檢查、剖胸探查術(shù)、ECT檢查、縱膈鏡檢查等為臨床常見(jiàn)的肺癌診斷檢查方法[3-4],不過(guò)從客觀上來(lái)講,上述方法都不是完善的,均存在著一定的缺陷與不足,如費(fèi)用高昂,操作復(fù)雜度較高,靈敏度較低,會(huì)對(duì)患者造成創(chuàng)傷等。與此同時(shí),應(yīng)用這些方法診斷肺癌還存在著檢測(cè)盲區(qū)、假陰性等問(wèn)題[5]。在這一背景下,想要有效提升肺癌患者的生存率,當(dāng)務(wù)之急在于探索出一套安全、簡(jiǎn)便的早期肺癌檢測(cè)方法。

    利用靈敏度高、簡(jiǎn)單快捷、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)的近紅外表面增強(qiáng)拉曼散射(near infrared surface?en?hanced Raman scattering,NIR?SERS)光譜技術(shù)可以直觀地獲取分子含量以及轉(zhuǎn)動(dòng)、振動(dòng)信息[6]。目前,這種技術(shù)在臨床領(lǐng)域已經(jīng)有了基本的應(yīng)用。醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域也逐步引入了此項(xiàng)技術(shù)。在本研究中,將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜,對(duì)肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測(cè)分析,主要通過(guò)785 nm近紅外激光波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)并分析研究氧合血紅蛋白,有利于提高肺癌SERS光譜技術(shù)診斷效率以及可行性。從一定程度上來(lái)講,NIR?SERS技術(shù)具備應(yīng)用于肺癌臨床診斷領(lǐng)域的潛力與價(jià)值。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 血液樣品:2015年5月至7月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院采集血液,從健康人和肺癌患者胳膊抽靜脈血液樣本各25例,樣品規(guī)格均為3 mL。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 提取氧合血紅蛋白 第一步,血液樣本編號(hào)。完成編號(hào)后分別提取每個(gè)樣本各2 mL,37℃室溫放置使其自然凝結(jié),放置時(shí)間為1 h,血樣凝結(jié)后利用小型臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行5000 r/min,5 min的離心處理,待樣品分層后將下層血紅細(xì)胞提取出并分裝至新的離心管中,提取量為200 μL。向提取的紅細(xì)胞中加入九倍體積的去離子水,緩慢混合后再次進(jìn)行5000 r/min,

    5min的離心處理,溶液分層后的中間層便是氧合血紅蛋白。抽取500 μL中間層溶液置于4°C保存,用于后續(xù)檢測(cè)處理。

    1.2.2 氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜測(cè)定 測(cè)定方案參照劉仁明等制備二維納米銀膜的方法[7],在納米銀膜基底上均勻涂覆制備好的氧合血紅蛋白樣品,涂覆量為60 μL,使其均勻覆蓋在基底上并形成直徑約1 cm的液體薄膜。待其自然干燥后利用美國(guó)海洋光學(xué)公司生產(chǎn)的便攜式拉曼光譜儀(R?2500TM)進(jìn)行檢測(cè)。NIR?SERS光譜的測(cè)定選取了785 nm激光波長(zhǎng),采用垂直照射的方法,參數(shù):激光功率密度J=103W·cm-2,每次掃描16 s,掃描次數(shù)為2次。為了降低實(shí)驗(yàn)誤差,各樣品分別測(cè)試三條譜線并取平均值。

    1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析與處理采用的工具包括2007excel、Origin 8.0、SPSS19.0、Raman Spectrum 等。

    2 結(jié)果

    2.1 氧合血紅蛋白NIR-SERS光譜 將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜,對(duì)肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測(cè)分析,每組研究對(duì)象的樣本數(shù)量均為25名,圖1A為25名健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜,圖1B為25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS 光譜。

    圖1 氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜

    將25名健康人(A)和25名肺癌患者(B)氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜求出平直曲線,并將譜線平均值向上/下平移處理,進(jìn)而獲取到直觀的對(duì)比結(jié)果。圖2為25名健康人(A)和25名肺癌患者(B)氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對(duì),由圖2可知,就氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜分析結(jié)果而言,兩組樣品具備明顯差異。相比于健康人,肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜強(qiáng)度相對(duì)較小。 在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm-1均出現(xiàn)了兩組研究樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜共有的譜峰;圖中健康人和肺癌患者光譜譜峰強(qiáng)度有明顯區(qū)別,相比于肺癌患者,在 662、723、816 cm-1等位置處健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度相對(duì)較大;473、816、1583 cm-1處健康人的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜出現(xiàn)的拉曼譜峰較肺癌患者更為明顯。另外,在1583 cm-1處,健康人氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象,藍(lán)移至 1579 cm-1,肺癌患者在1208、1425 cm-1處譜峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象,移動(dòng)至 1212、1432 cm-1。

    圖2 25名健康人(a)和25名肺癌患者(b)氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對(duì)

    2.2 t檢驗(yàn)結(jié)果分析 對(duì)25名健康人和25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜扣除熒光背景,由于光譜中信息主要來(lái)自譜峰的相對(duì)強(qiáng)度和形狀,故將在400~1800 cm-1范圍內(nèi)的譜峰進(jìn)行面積歸一化,面積歸一化可以消除由于實(shí)驗(yàn)條件的微小差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)采用的面積歸一法就是指把氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜的譜峰面積逐個(gè)算出來(lái)(采用 Origin作圖軟件計(jì)算譜峰面積),如 S1、S2、S3.....Sn,然后把每個(gè)譜峰的面積相加得 S 總,再用每個(gè)譜峰的面積 S1、S2、S3.....Sn 除以總面積 S 總得到每個(gè)譜峰所占的面積比 A1、A2、A3...An,即An=Sn/S總。表1是 25名健康人和 25名肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm-19處譜峰面積的顯著性分析。

    通過(guò)表1顯著性分析可以看出肺癌患者相對(duì)正常人在473 cm-1處譜峰面積 A1和1583 cm-1處譜峰面積A9有所減小,達(dá)到顯著水平。肺癌患者相對(duì)正常人在816 cm-1處譜峰面積A4明顯減小,達(dá)到極顯著水平。對(duì)25名健康人和25名肺癌患者在473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm-19 處譜峰面積的顯著性分析得出的結(jié)果與上述NIR?SERS光譜分析基本吻合,從而更加驗(yàn)證了上述分析結(jié)論。

    表1 25 例健康人和 25 例肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm-19 處譜峰面積的顯著性分析

    3 討論

    從表1氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬[9-12]中能夠清晰直觀地了解生物分子變化所導(dǎo)致的肺癌患者血紅蛋白NIR?SERS光譜變化的具體機(jī)理,氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)(CaCm)的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)分別是引發(fā)處于1425、1583 cm-1附近的拉曼譜峰的根本原因;吡咯環(huán)間CmH基團(tuán)的變形振動(dòng)是引發(fā)處于1208 cm-1附近的拉曼譜峰的根本原因;吡咯半環(huán)的反對(duì)稱以及對(duì)稱伸縮振動(dòng)分別是引發(fā)處于1126、1336 cm-1附近的拉曼譜峰的根本原因。

    由圖2可知,相比于健康人而言,在1583、816、473 cm-1處肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度較小,從表2氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬得知上述三個(gè)譜峰的產(chǎn)生原因分別為氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)(CaCm)的反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)、氧合血紅蛋白吡咯環(huán)的對(duì)稱和反對(duì)稱變形振動(dòng)、氧合血紅蛋白水合高鐵血紅蛋白吡咯環(huán)折疊振動(dòng),上述結(jié)果的依據(jù)為血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬分析結(jié)果。肺癌患者的譜峰之所以小于正常人,主要原因是上述三種振動(dòng)模式數(shù)量的減少。另外,由于氧合血紅蛋白吡咯環(huán)以及氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)的振動(dòng)會(huì)影響人氧合血紅蛋白平均 NIR?SERS光譜在1583 cm-1的譜峰變化,因此,當(dāng)肺癌患者新陳代謝紊亂、惡性腫瘤組織異常增大后,其氧合血紅蛋白分子乙稀基團(tuán)、氧合血紅蛋白吡咯環(huán)的構(gòu)象以及模式往往會(huì)產(chǎn)生變化,進(jìn)而異于健康人的譜峰移動(dòng)情況[12]。

    通過(guò)NIR?SERS光譜分析并對(duì)比兩組研究對(duì)象的氧合血紅蛋白情況,結(jié)果表明,兩組樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度均存在明顯差異。相比于健康人,肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度均相對(duì)較小。對(duì)上述現(xiàn)象的內(nèi)在原理加以分析后發(fā)現(xiàn),肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度之所以會(huì)減小,可能是由于惡性腫瘤組織異常增大所引發(fā)的,在這一過(guò)程中,患者上皮粘膜組織微血管的增生會(huì)直接引發(fā)其微血管含氧量的下降,進(jìn)而誘使腫瘤組織中氧合血紅蛋白含量降低[8]。上述變化能夠通過(guò)氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜情況來(lái)加以表征。

    表2 氧合血紅蛋白的譜峰歸屬[8-11]

    在本研究中,將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜,對(duì)肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測(cè)分析。結(jié)果顯示,兩組研究對(duì)象的NIR?SERS光譜和譜峰強(qiáng)度均具備顯著差異,相比于健康人,在1583、816、473 cm-1處肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度較小,正常人的氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜在 1208、1425 cm-1譜峰處肺癌患者分別紅移至1212、1432 cm-1,通過(guò)對(duì)氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜分析,觀察到健康人在1583 cm-1的譜峰藍(lán)移到1579 cm-1。上述譜峰均與氧合血紅蛋白吡咯環(huán)和乙烯基團(tuán)(CaCm)的振動(dòng)有關(guān)。對(duì)于肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度減小。因此通過(guò)肺癌組和對(duì)照組的譜峰強(qiáng)度變化揭示了氧合血紅蛋白NIR?SERS用于診斷肺癌的潛力。利用氧合血紅蛋白的NIR?SERS進(jìn)行肺癌或其他疾病的診斷是一項(xiàng)簡(jiǎn)單快捷、生物兼容性好的技術(shù),從一定程度上來(lái)講,NIR?SERS技術(shù)具備應(yīng)用于肺癌或其他疾病臨床診斷領(lǐng)域的潛力與價(jià)值。

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