泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡受體1及其下游因子相關(guān)表達(dá)研究

朱騰 晉紅中

100730北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科

泛發(fā)性膿皰性銀屑?。╣eneralized pustular psoriasis，GPP）是一種系統(tǒng)性炎癥性皮膚病，臨床上通常以突發(fā)紅斑以及紅斑基礎(chǔ)上粟粒大小的無(wú)菌性膿皰為主要特點(diǎn)［1?2］。有研究表明，程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1）基因缺陷可促進(jìn)γδT細(xì)胞及Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL?17及IL?22，從而增加對(duì)中性粒細(xì)胞的招募，導(dǎo)致銀屑病樣皮炎的發(fā)生［3］。提示PDCD1及其相關(guān)受體通路可能與GPP的發(fā)生有關(guān)。本研究檢測(cè)PDCD1受體及下游NF?κB在GPP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中的表達(dá)量，并檢測(cè)GPP患者血清中下游白細(xì)胞介素17（IL?17）、IL?22及IL?4的含量。

一、對(duì)象

2015年5月至2016年11月就診于北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科的GPP患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：18～75周歲，性別不限，經(jīng)臨床及組織病理確診為GPP，入組時(shí)處于膿皰發(fā)作期。排除標(biāo)準(zhǔn)：抽血前2個(gè)月內(nèi)曾系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、維A酸類(lèi)、生物制劑及免疫抑制劑等藥物；伴有其他類(lèi)型皮膚病、腫瘤、其他自身免疫病或其他嚴(yán)重疾患。入選GPP患者23例，女11例，男12例，平均年齡35.3歲。健康對(duì)照組24例選自北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心，女12例，男12例，平均年齡38.1歲。兩組間性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1.標(biāo)本：采集23例GPP患者及24例健康對(duì)照者外周血，分離血清及使用密度梯度離心法提取PBMC。

2.RT?PCR檢測(cè)PBMC中PDCD1及其配體（PD?L1和PD?L2）和NF?κB mRNA的表達(dá)：Trizol法提取PBMC中總RNA，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅從9例GPP患者及10例健康對(duì)照者成功提取RNA，患者組（9例）和對(duì)照組（10例）間性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表1。將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每升高1℃采集5次熒光信號(hào)。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，使用2?△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.血清中 IL?17、IL?22及IL?4含量檢測(cè)：使用美國(guó)quanticyto公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)23例GPP患者以及24例健康對(duì)照者血清中的IL?4、IL?17、IL?22。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、結(jié)果

1.PBMC中PDCD1、PD?L1、PD?L2及NF?κB mRNA表達(dá)水平：GPP患者組PDCD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，PD?L1、PD?L2 mRNA均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組NF?κB mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.血清中IL?4、IL?17及IL?22表達(dá)水平：患者組IL?4、IL?17、IL?22表達(dá)量均高于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表3。

表1 程序性細(xì)胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1、PD?L2）、NF?κB基因引物序列

表2 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1和PD?L2）以及NF?κB mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡受體1（PDCD1）及配體（PD?L1和PD?L2）以及NF?κB mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）

組別患者組對(duì)照組t值P值例數(shù)9 10 PDCD1 3.13±4.62 23.70±15.33 3.40＜0.05 PD?L1（× 10?4）5.70±3.07 2.00±1.98 2.96＜0.05 PD?L2（× 10?4）0.95±0.71 0.16±0.20 3.38＜0.05 NF?κB（× 10?3）1.90±0.82 1.50±0.91 0.75＞0.05

表3 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中白細(xì)胞介素4（IL?4）、IL?17及IL?22表達(dá)水平（± s）

表3 泛發(fā)性膿皰性銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中白細(xì)胞介素4（IL?4）、IL?17及IL?22表達(dá)水平（± s）

組別患者組對(duì)照組t值P值例數(shù)23 24 IL?4 99.46±74.74 17.34±47.87 4.46＜0.001 IL?17 304.19±280.66 62.38±84.03 3.96＜0.001 IL?22 338.37±245.44 28.10±84.88 5.74＜0.001

四、討論

PDCD1是通過(guò)減數(shù)雜交技術(shù)從小鼠T淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞克隆而成，其胞質(zhì)區(qū)域N端含有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序，C端為一個(gè)免疫受體酪氨酸活化基序，與胞內(nèi)細(xì)胞傳導(dǎo)有關(guān)［4］。有研究表明，PDCD1分子的基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5］、多發(fā)性硬化［6］發(fā)病相關(guān)，但尚無(wú)PDCD1 與GPP的研究。

PDCD1及其配體結(jié)合后的抑制途徑在T細(xì)胞反應(yīng)的各個(gè)階段都發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用［7］，若阻斷PDCD1及其配體途徑，T細(xì)胞將缺失有效的負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)，從而導(dǎo)致免疫性疾病的發(fā)生。PD?L1與PD?L2均可表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞表面，并且隨著這些細(xì)胞的活化而上調(diào)［8］。本研究結(jié)果顯示，GPP患者與健康對(duì)照者比較，PBMC中PDCD1 mRNA表達(dá)降低，PD?L1、PD?L2 mRNA表達(dá)升高?？赡苁怯捎贕PP患者PBMC中PDCD1基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，PDCD1的負(fù)性調(diào)控信號(hào)減弱，下游信號(hào)通路的NF?κB等分子過(guò)度激活，從而導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等過(guò)度活化，產(chǎn)生大量的炎癥因子。也有研究表明，PD?L1及PD?L2高表達(dá)的淋巴細(xì)胞可以誘導(dǎo)PDCD1的表達(dá)［9］，因此，PD?L1及PD?L2的上調(diào)也可能是機(jī)體對(duì)PDCD1的表達(dá)量下調(diào)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。

有研究證實(shí)，PDCD1基因缺陷能夠誘發(fā)小鼠銀屑病樣皮炎［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，GPP患者外周血血清中IL?4、IL?17及IL?22濃度顯著增加。這可能與PDCD1基因缺失后失去抑制γδT細(xì)胞及Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL?17及IL?22的能力，使得IL?17及IL?22的水平明顯增高，從而極大地增加了對(duì)中性粒細(xì)胞的招募而導(dǎo)致銀屑病樣皮炎的發(fā)生，同時(shí)IL?4水平增高可進(jìn)一步上調(diào)PD?L2表達(dá)。而在GPP患者的皮損組織病理中常見(jiàn)表皮海綿狀膿皰，位于棘細(xì)胞上層（Kogoj海綿狀膿皰）和角質(zhì)層中（Munro微膿瘍）。這提示PDCD1的缺失可能導(dǎo)致炎癥通路的過(guò)度激活，從而導(dǎo)致或加劇GPP的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，PDCD1及其配體在GPP患者PBMC中表達(dá)異常，但是否可以通過(guò)制備PDCD1功能性蛋白、增強(qiáng)PDCD1的負(fù)性信號(hào)對(duì)GPP進(jìn)行靶向治療有待進(jìn)一步研究。

［1］Reich A.Interleukin?17 blockade in generalized pustular psoriasis?new hope for severely ill patients［J］.Br J Dermatol,2017,176（3）:572?573.doi:10.1111/bjd.14987.

［2］Posso?De LRCJ,Pope E.New insights into pustular dermatoses in pediatric patients［J］.J Am Acad Dermatol,2014,70（4）:767 ?773.doi:10.1016/j.jaad.2013.11.005.

［3］Imai Y,Ayithan N,Wu X,et al.Cutting edge:PD?1 regulates imiquimod?induced psoriasiform dermatitis through inhibition of IL?17A expression by innate γδ?low T cells［J］.J Immunol,2015,195（2）:421?425.doi:10.4049/jimmunol.1500448.

［4］Nishimura H,Nose M,Hiai H,et al.Development of lupus?like autoimmune diseases by disruption of the PD?1 gene encoding an ITIM motif?carrying immunoreceptor［J］.Immunity,1999,11（2）:141?151.

［5］do CLM,Farias TD,Medeiros MD,et al.Association of PDCD1 polymorphism to systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis susceptibility［J］.Rev Bras Reumatol Engl Ed,2016,56（6）:483?489.doi:10.1016/j.rbre.2015.07.008.

［6］Pittet CL,Newcombe J,Prat A,et al.Human brain endothelial cells endeavor to immunoregulate CD8 T cells via PD?1 ligand expression in multiple sclerosis［J］.J Neuroinflammation,2011,8:155.doi:10.1186/1742?2094?8?155.

［7］Miyajima M,Zhang B,Sugiura Y,et al.Metabolic shift induced by systemic activation of T cells in PD?1?deficient mice perturbs brain monoamines and emotional behavior［J］.Nat Immunol,2017,18（12）:1342?1352.doi:10.1038/ni.3867.

［8］Berghoff AS,Ricken G,Widhalm G,et al.PD1（CD279）and PD?L1（CD274,B7H1）expression in primary central nervous system lymphomas（PCNSL）［J］.Clin Neuropathol,2014,33（1）:42?49.

［9］Chen J,Wu XJ,Wang GQ.Hepatoma cells up?regulate expression of programmed cell death?1 on T cells［J］.World J Gastroenterol,2008,14（44）:6853?6857.