姜黃素-PLGA納米粒對(duì)RG2大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型的影響

周春輝，郭寶瑞，胡晨浩，張劍寧*

0 引言

姜黃素是姜黃的活性成分，對(duì)多種癌癥[包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)]有顯著的抗腫瘤作用，但姜黃素吸收差，生物利用度低。另外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療失敗的主要原因之一是血腦屏障，為了克服這一障礙，需要高劑量使用抗腫瘤藥物，導(dǎo)致毒副作用增強(qiáng)。因此，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤更有效、更安全的治療需要穿越血腦屏障，靶向腫瘤，這可以通過藥物遞送系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)[1-2]。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是一種作為姜黃素遞送系統(tǒng)的前景性藥物[3]。體外研究證明，載姜黃素的納米粒和納米纖維對(duì)C6和9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有劑量依賴性的細(xì)胞毒副反應(yīng)[4]。在結(jié)腸癌、宮頸癌和前列腺癌中，已顯示出載姜黃素PLGA的功效[5]。在此基礎(chǔ)上，本文旨在評(píng)估腫瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)施用載姜黃素PLGA-DSPE-PEG納米粒對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤(RG2)腫瘤模型的抗腫瘤功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 姜黃素、乙腈(均為阿拉丁試劑)，DSPE-PEG、卵磷脂(購(gòu)自Lipid公司)；醫(yī)用PLGA(長(zhǎng)春圣博瑪生物材料有限公司)。

高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)，包括紫外(UV)檢測(cè)器(425 nm)和色譜柱(ODS2 C18200 mm×4.6 mm)；超聲波水浴儀(Branson B 220 Smith Kline，美國(guó))；Malvern Zetasizer Nano系列ZS裝置。

48只成年雌性Wistar大鼠，體重250～300 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。

1.2 姜黃素含量測(cè)定 根據(jù)Wichitnithad等[6]報(bào)道的方法，通過高效液相色譜(HPLC)分析姜黃素的含量。使用配有紫外(UV)檢測(cè)器(425 nm)和色譜柱(ODS2 C18200 mm×4.6 mm)的Agilent HPLC系統(tǒng)(Agilent 1100，美國(guó))。流動(dòng)相包括乙腈和2% v/v乙酸(40∶60，v/v)，流速為2.0 mL/min。色譜法通過線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和特異性驗(yàn)證。

1.3 Cur-NP的制備 在混合納米粒的制備中，使用PLGA和1,2-二硬脂?；?甘氨酰-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(PEG)-2000](DSPE-PEG)作為共聚物(銨鹽)。通過超聲乳化法制備PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒子[7]。將PLGA(共聚物比為85∶15)溶于乙腈(2.5 μg/ml)中，獲得有機(jī)相。在有機(jī)相制備過程中，加入姜黃素[姜黃素/PLGA(w/w)=20%]。將卵磷脂和DSPE-PEG分別溶解在4% (v/v)乙醇中，然后與去離子水混合獲得水相。將水相加入到有機(jī)相(比例為10∶1)中，并使用超聲波水浴儀(Branson B 220 Smith Kline，美國(guó))在頻率42 kHz和功率100 W下，在玻璃小瓶中超聲處理5 min。將納米粒在10 kDa分子尺寸可滲透膜(微孔，10 kDa)的過濾離心管中離心，并使用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗滌3次。將獲得的納米粒分散體在-80 ℃下冷凍干燥24 h。

1.4 納米粒的表征 通過Malvern Zetasizer Nano系列ZS裝置測(cè)量納米粒的粒徑。通過HPLC法測(cè)定藥物包載量。通過破壞有機(jī)溶劑的納米粒結(jié)構(gòu)，將乙腈加入納米粒中以提取藥物。將溶液通過0.2 μm膜過濾器過濾并注入HPLC柱。采用透析法測(cè)定姜黃素的體外釋放行為[8]。將納米粒分散于PBS中并置于2 000 Da孔徑的透析袋內(nèi)，將該透析袋置于37 ℃的磁力攪拌器(100 r/min)攪拌的水浴中。以預(yù)定的時(shí)間間隔，采用HPLC法對(duì)整個(gè)釋放基質(zhì)進(jìn)行提取與分析。

1.5 體外實(shí)驗(yàn) 將含5×103細(xì)胞的RG2細(xì)胞懸浮液100 μl加入96孔平底板中。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中保持過夜以使其附著于孔。第2天用姜黃素溶液(12.5、25、50、100、200 μmol/L)處理細(xì)胞并孵育72 h。用WST-1 [5-(2,4-二磺基苯基)-2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-2H-四唑內(nèi)鹽]測(cè)試進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。

1.6 動(dòng)物研究 研究列入48只成年雌性Wistar大鼠(250～300 g)。將動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，并在給藥前給予0.05 mg環(huán)孢菌素5 d。

腦腫瘤的誘導(dǎo)方法：使用Yemisci等[9]和Geletneky等[10]的改良方法。經(jīng)腹膜內(nèi)施用氯胺酮(80 mg/kg)和木霉素(10 mg/kg)混合物麻醉后，將50×104個(gè)RG2細(xì)胞/5 μl細(xì)胞注射到大鼠腦中。為獲得所需數(shù)量的RG2細(xì)胞，將RG2細(xì)胞懸浮液加入到DMEM培養(yǎng)液中，于2 000 r/min離心5 min，細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

RG2細(xì)胞的注入方法：將大鼠置于立體定位儀(圖1A、圖1B)中。將頭皮剃光，將含有50×104RG2細(xì)胞的5 μl細(xì)胞懸液用Hamilton玻璃注射器單側(cè)注射到右前紋狀體，坐標(biāo)為前后-0.5 mm，側(cè)面+3.0 mm，腹側(cè)-6 mm。手術(shù)中，通過直腸探針連續(xù)監(jiān)測(cè)體溫，并用恒溫盤保持在(37.0±1) ℃。RG2細(xì)胞植入后，對(duì)大鼠進(jìn)行日?；顒?dòng)和全身健康隨訪，處死對(duì)環(huán)境無興趣、對(duì)外部刺激無反應(yīng)、不進(jìn)行自體喂養(yǎng)且紅眼的大鼠。

圖1將RG2細(xì)胞注入右側(cè)紋狀體前后-0.5mm，側(cè)面+3.0mm，腹側(cè)-6mm

注：A.RG2細(xì)胞注射后大鼠腦的冠狀切片；B.立體定位儀定位；C.3 Tesla MR單元的大鼠成像，開發(fā)直徑3.5 cm 圓形環(huán)元件的手工制造的8通道僅接收相位陣列表面線圈；D.腦腫瘤的出現(xiàn)和頭尾向的冠狀面MR圖像體積的測(cè)量(高度)和從左到右長(zhǎng)度的測(cè)量(橫向)

模型驗(yàn)證：在腫瘤細(xì)胞植入后10 d，通過磁共振成像(MR)評(píng)估腦腫瘤的存在和大小。MR成像測(cè)量腫瘤大小后，腦腫瘤體積15～30 mm2的大鼠納入研究組。在MR成像同一天，將藥物溶液或制劑注射到靜脈注射組大鼠的尾靜脈中，和與腫瘤內(nèi)治療組細(xì)胞著床的同一坐標(biāo)的腦內(nèi)。腫瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)注入的藥液體積或納米粒分散體積[在含有Tween-20(0.1%，w/v)的PBS中制備]均為大鼠腫瘤耐受量(20 μl)。注射前該制劑在UV光下滅菌30 min[11]。

實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠隨機(jī)分為7組，每組6只：①未經(jīng)處理(對(duì)照組)；②經(jīng)瘤內(nèi)空白納米粒處理(不含姜黃素)；③靜脈注射空白納米粒(不含姜黃素)；④瘤內(nèi)姜黃素處理(25 μmol/L)；⑤用姜黃素靜脈注射(25 μmol/L姜黃素溶液，不含納米粒)處理；⑥用包含25 μmol/L姜黃素的Cur-NP負(fù)載瘤內(nèi)處理；⑦用姜黃素瘤內(nèi)注射(25 μmol/L姜黃素溶液)用包含25 μmol/L姜黃素的靜脈內(nèi)Cur-NP處理(表1)。

表1 研究分組

注：NP：納米粒，CC：姜黃素；it：腫瘤內(nèi)，iv：靜脈注射

2 結(jié)果

Cur-NP的粒徑為(169±4.8)nm，多分散性指數(shù)(PI)為0.22，該藥物包封率為35%±1.2%。體外藥物釋放研究表明姜黃素的釋放在168 h結(jié)束(圖2)。

2.1 腦腫瘤的影像學(xué)和病理學(xué) 在48只實(shí)驗(yàn)小鼠中，經(jīng)RG2細(xì)胞注射10 d后，42只大鼠出現(xiàn)了腦腫瘤，并對(duì)其進(jìn)行了靜脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)注射。MR成像顯示腫瘤粗糙，T2高信號(hào)，伴有壓迫和疝出現(xiàn)，根據(jù)其大小而定。對(duì)大腦的宏觀檢測(cè)中，我們?cè)赗G2細(xì)胞注射部位觀察到灰色占位性病變。顯微鏡下，腫瘤細(xì)胞呈多形性核團(tuán)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的出血、壞死和微血管增生特征明顯。腫瘤完全由腫瘤細(xì)胞組成，無炎癥反應(yīng)(圖3)。對(duì)照組(組1)4只小鼠在第2次MR成像前死亡，可能原因是增加的顱內(nèi)壓和腦疝。

2.2 治療對(duì)腫瘤大小和病理的影響 根據(jù)兩者治療后的MR成像和病理測(cè)量腫瘤大小，

圖2姜黃素HPLC色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線及姜黃素-PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒的體外藥物釋放曲線(n=3)

圖3瘤內(nèi)注射載Cur-NP前后蘇木精-伊紅染色的大鼠腦腫瘤組織病理學(xué)圖像

注：藥物注射前(A、B、C)可見微血管增生(A，40×)，假柵欄狀壞死和多形性(B，100×)和致密腫瘤細(xì)胞(C，400×)；瘤內(nèi)注射載Cur-NP后(D、E、F)，可見血管增生減少(D，40×)和假柵欄狀壞死和多形性減少(E，100×)。在400×放大倍數(shù)下觀察到巨核細(xì)胞和含鐵血黃素巨噬細(xì)胞(F)治療前僅由MR成像確定。5 d后瘤內(nèi)注射Cur-NP組腫瘤體積減小(P=0.028)，而在未治療對(duì)照組腫瘤體積增大(P=0.036)，而其他組治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，只有瘤內(nèi)注射Cur-NP才能使腫瘤體積減小。見表2。

表2 研究組治療前后的腫瘤體積(mm3)

注：*Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)

腫瘤大小百分比變化比較見表3。結(jié)果顯示，靜脈內(nèi)Cur-NP組(第3組)或靜脈內(nèi)Cur-NP組(第7組)的腫瘤體積變化率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095或P=0.381)，其腫瘤體積增加并無顯著差異。結(jié)合表2和表3的結(jié)果，可見注射姜黃素組(第4組)或瘤內(nèi)Cur-NP組(第6組)比其他組有更好的抗腫瘤作用，表明只有腫瘤內(nèi)應(yīng)用姜黃素具有抗腫瘤的作用。此外，負(fù)載姜黃素的納米粒子瘤內(nèi)注射，與單用姜黃素比較，能更著地減小腦腫瘤體積。

3 討論

姜黃素是一種對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有抗腫瘤活性的植物化學(xué)成分，其作用包含各種機(jī)制，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬，上調(diào)雙特異性磷酸酶-2，抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和c-Jun N端激酶，下調(diào)細(xì)胞增殖及端粒酶有關(guān)的基因活性。已有姜黃素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抗腫瘤活性的報(bào)道[12-13]。姜黃素與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用是預(yù)防和治療腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，在臨床化療中具有抗癌、逆轉(zhuǎn)耐藥及減毒的多重作用[14]，有助于提高化療療效，已有多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，姜黃素對(duì)多種癌癥有顯著的抗腫瘤作用[15-18]。但姜黃素穩(wěn)定性和溶解性低，其臨床試驗(yàn)療效報(bào)道也曾出現(xiàn)無效結(jié)論。因此，通過納米遞送系統(tǒng)解決姜黃素的穩(wěn)定性、溶解性低的問題，對(duì)于姜黃素的應(yīng)用具有重要意義，尤其是在治療腦腫瘤方面，納米粒子療法比傳統(tǒng)療法更有優(yōu)勢(shì)，可通過血腦屏障和增加藥物在靶組織的濃度[19]。

為了利用藥物輸送系統(tǒng)，提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度，降低藥物的毒性，我們使用了PLGA和DSPE-PEG制備雜化納米粒子來包載姜黃素。本研究用RG2細(xì)胞來誘導(dǎo)小鼠中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，與常用的其他模型相比，RG2模型具有非免疫原性的優(yōu)點(diǎn)[20]。對(duì)在小鼠腦腫瘤模型中腫瘤微觀結(jié)構(gòu)和抗腫瘤藥物的反應(yīng)研究，通常用組織病理學(xué)進(jìn)行評(píng)估。本研究中，除組織病理學(xué)評(píng)估外，還應(yīng)用磁共振成像來測(cè)量腫瘤面積。鑒于MR成像和病理腫瘤測(cè)量的一致性，在小鼠不被處死的前提下，MR成像可以用來監(jiān)測(cè)治療大鼠腦內(nèi)的腫瘤。

本研究中，對(duì)照組的腫瘤大小在5 d后顯著增加。在應(yīng)用于靜脈內(nèi)的空的或負(fù)載姜黃素的納米粒子組中，腫瘤仍然在增長(zhǎng)，表明靜脈給藥組通過血腦屏障的藥物不足。然而，雖然靜脈注射姜黃素不能引起腫瘤大小的減少，但存在限制腫瘤生長(zhǎng)的趨勢(shì)。同樣，空納米粒瘤內(nèi)注射阻止腫瘤生長(zhǎng)。由瘤內(nèi)注射造成的損傷和局部炎癥可能是瘤內(nèi)給藥抑制腫瘤生長(zhǎng)納米粒子引起的[21]。CurNP瘤內(nèi)注射在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤上具有顯著的抗腫瘤活性。納米粒裝載有抗腫瘤藥物的瘤內(nèi)注射，作為腦腫瘤組織給藥方法，值得深入研究。

表3 研究組腫瘤體積變化百分比和組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

注：*Mann Whitney U檢驗(yàn)

本研究的主要局限是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究樣本量較小。另一個(gè)問題是缺乏T1加權(quán)后的MR成像。然而，因?yàn)槟[瘤并不總是以釓為基礎(chǔ)的造影劑顯示增強(qiáng)[22]，T2加權(quán)影像學(xué)及病理切片顯示腫瘤區(qū)域非常相似，因此，缺乏T1加權(quán)成像在本研究中不是一個(gè)主要限制?？傊d姜黃素的PLGA-DSPE-PEG雜化納米粒子瘤內(nèi)應(yīng)用顯著減少腫瘤的大小，進(jìn)一步研究還需要對(duì)PLGA-DSPE-PEG納米粒子的工藝進(jìn)行優(yōu)化以適合放大生產(chǎn)，以及體內(nèi)外對(duì)PLGA-DSPE-PEG納米粒子進(jìn)行系統(tǒng)性毒性和機(jī)制評(píng)價(jià)。

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