BST-2參與HCMV感染誘導(dǎo)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移

王淋淋， 李瑩瑩， 王 語， 張 麗， 胡 明， 王 斌， 李 玲＊

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 人體解剖與組織胚胎學(xué)系，山東 青島 266071；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 免疫學(xué)系，山東 青島 266071；3. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 特種醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266071)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是皰疹病毒β亞科的雙鏈DNA病毒，在我國人群感染率為70%～90%。免疫功能健全的人感染HCMV后常無癥狀，但病毒可終生潛伏存在。這種病毒和宿主細(xì)胞的長期并存可能對腫瘤的分化、遷移、侵襲等生物學(xué)行為產(chǎn)生一系列影響。HCMV不是公認(rèn)的致瘤病毒，但研究顯示在多種腫瘤組織中可以檢測到HCMV蛋白產(chǎn)物及基因組，如膠質(zhì)瘤[1-3]、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等。膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，大多呈侵潤性增長，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，手術(shù)治療復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差，具有較高的致死率。近年來的研究提示HCMV感染與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)[1-3]，本課題組的前期研究也表明，HCMV感染能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的腫瘤干性[4]，提示HCMV感染在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至惡化的過程中發(fā)揮了一定的作用，但HCMV參與腫瘤發(fā)生以及調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制尚未闡明。骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原2(Bone Marrow Stromal cell antigen 2，BST-2，又命名為Tetherin /CD317 /HN1.24)是分子量大小為30～60 kD的II型跨膜蛋白,由181個氨基酸組成。結(jié)構(gòu)分為N端胞質(zhì)區(qū)(CT)、跨膜區(qū)(TM)、胞外區(qū)(EC)和C端糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨，其中TM區(qū)和GPI區(qū)均為膜錨定結(jié)構(gòu)[5]。BST-2被認(rèn)為是一種天然的抗病毒免疫蛋白，對很多種類病毒釋放具有明顯的抑制作用[6-8]，但是BST-2并不能夠抑制HCMV的釋放，有研究證實BST-2能夠促進(jìn)HCMV進(jìn)入宿主細(xì)胞，下調(diào)BST-2表達(dá)可有效降低HCMV復(fù)制[9]。近年來研究表明，BST-2表達(dá)還與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。BST-2高表達(dá)的胃腸道腫瘤患者預(yù)后較差[10]，體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)小鼠荷瘤實驗均證實高表達(dá)BST-2可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤，抑制BST-2可使腫瘤的遷移和侵襲能力降低[11]。但目前BST-2促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制尚未闡明。我們在前期的研究中證實，HCMV感染可誘導(dǎo)人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251上調(diào)表達(dá)BST-2，其表達(dá)與對照組相比可上調(diào)達(dá)250倍。推測BST-2可能是HCMV感染膠質(zhì)瘤后影響膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的一個關(guān)鍵靶點，BST-2與HCMV感染以及膠質(zhì)瘤的關(guān)系值得進(jìn)一步深入探討和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞 HCMVAD169株由法國巴斯德研究所贈送。通過人胚肺成纖維細(xì)胞擴(kuò)增,待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時刮取細(xì)胞和上清，反復(fù)凍融3次后，空斑定量病毒滴度，保存于-86 ℃。本研究所用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值為1和0.1。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 MEM(Hyclone)；胎牛血清(FBS，Gibco)；鼠抗HCMV IE單克隆抗體、兔抗人BST-2單克隆抗體購自Abcam；兔抗β-actin、羊抗兔IgG購自北京博奧森；羊抗鼠IgG購自SANTA CRUZ；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒和LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物;BST-2 shRNA表達(dá)載體由上海吉瑪設(shè)計和合成；24孔板用transwell小室(8.0 μm PET)購自MillIPORE；蛋白裂解液RIPA、PMSF(Solarbio)；化學(xué)發(fā)光試劑盒(MIllipore)；凝膠成像分析系統(tǒng)(富士);酶標(biāo)儀(SUNRISE)。

1.2 方法

1.2.1 HCMV感染 對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種六孔板(5×105/孔)，10% FBS的MEM，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時，換為無血清MEM培養(yǎng)同時加入相應(yīng)MOI值的HCMV,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換10% FBS培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)試驗，其他未感染細(xì)胞除不加入HCMV外，操作相同。

1.2.2 RNA干擾 由上海吉瑪設(shè)計和合成靶基因為人BST-2的4個短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒和1個陰性對照質(zhì)粒，靶序列結(jié)構(gòu)如下：shBST2-128, 5′-GGGATAAGCGCTGTAAGCTTC-3′; shBST2-171,5′-GCTCCTGATCATCG-TGATTCT-3′;shBST2-256,5′-GCAGTGATGGAGTGTCGCAAT-3′;shBST2-432,5′-GGGAGAGATCACTACATTAAA-3′。HCMV感染后4 h，將8 μL LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑和4 μg shRNA干擾質(zhì)粒各加入250 μL MEM培養(yǎng)基后輕輕混合孵育20 min，加入6孔板內(nèi)細(xì)胞，6 h后除去轉(zhuǎn)染試劑更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后提取蛋白，通過Western blot方法篩選有效沉默靶點后進(jìn)行后續(xù)實驗，具體操作步驟相同。

1.2.3 細(xì)胞劃痕愈合實驗 經(jīng)HCMV感染和RNA干擾BST-2后24 h的U251細(xì)胞接種于6孔板(1×106/孔)，滅菌牙簽劃線，2% FBS MEM培養(yǎng)，分別在0、24、48 h拍照。數(shù)據(jù)采用Photoshop軟件測量劃痕相對寬度，多次測量用Graphpad Prism5作柱狀圖，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩組間采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05表示差別有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCMV感染促進(jìn)U251細(xì)胞遷移

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，對照組、HCMV MOI=0.1組與HCMV MOI=1組在0 h時，劃痕距離大致相同。24 h后可見感染HCMV細(xì)胞劃痕距離縮短，與對照組相比，具有明顯的細(xì)胞遷移增強(qiáng)特征(P<0.01)，其中高M(jìn)OI值(MOI=1)組相比低MOI值(MOI=0.1)組細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)。48 h實驗結(jié)果與24 h類似(圖1)。

圖1 U251細(xì)胞感染不同濃度HCMV后隨時間變化的細(xì)胞遷移情況Fig.1 U251 cells infected with different concentrations of HCMV changes with time of cell migration***：相對于對照組，P<0.01***：compared with control group，P<0.01

2.2 HCMV感染促進(jìn)U251細(xì)胞高表達(dá)BST-2

不同MOI值HCMV感染U251細(xì)胞后Western-blot結(jié)果顯示，未感染HCMV的U251細(xì)胞(MOCK)不表達(dá)HCMV的標(biāo)志蛋白IE，低表達(dá)BST-2。隨感染時間延長，出現(xiàn)IE表達(dá)，證實建立病毒感染。BST-2蛋白表達(dá)量在HCMV感染后24～72 h內(nèi)呈時間依賴關(guān)系，但不同MOI值HCMV感染后的同一時段內(nèi)，BST-2表達(dá)差異沒有顯著性(圖2)。

圖2 U251細(xì)胞感染HCMV后BST-2蛋白表達(dá)Fig.2 BST-2 protein expression of U251 cells infected HCMV***：相對于shNC組，P<0.01，下圖同***：compared with shNC group，P<0.01，same the follow

2.3 BST-2 shRNA靶序列篩選結(jié)果

HCMV(MOI=1)感染U251細(xì)胞后4 h，分別轉(zhuǎn)染靶基因為BST-2的4種shRNA質(zhì)粒(siBST-2-128、siBST-2-256、siBST-2-171、siBST-2-432)和陰性對照shRNA質(zhì)粒(shNC),48 h后Western-blot結(jié)果顯示siBST-2-171與siBST-2-256兩種靶序列對BST-2的沉默具有顯著效果(P<0.01)(圖3)。隨后即選擇這兩種質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 BST-2 shRNA靶序列篩選Fig.3 ShRNA targets sequence screening

2.4 HCMV感染后下調(diào)BST-2表達(dá)抑制HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

將U251細(xì)胞感染或模擬感染HCMV(MOI=1)后，分別轉(zhuǎn)染siBST-2-171、siBST-2-256、shNC或不做處理，48 h后Western-blot檢測BST-2、HCMV IE和內(nèi)參β-actin。結(jié)果顯示，未感染HCMV的細(xì)胞不表達(dá)IE蛋白，感染HCMV的細(xì)胞表達(dá)IE，證實已經(jīng)在U251內(nèi)建立HCMV感染(圖4A)。未感染HCMV的U251低表達(dá)BST-2，與轉(zhuǎn)染shNC質(zhì)粒組相比，差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，轉(zhuǎn)染siBST-2-171、siBST-2-256與shNC相比，BST-2蛋白表達(dá)量明顯下降(圖4A、4B)。HCMV感染明顯上調(diào)BST-2表達(dá)，轉(zhuǎn)染siBST-2-171、siBST-2-256后，BST-2表達(dá)下降明顯(圖4A、4B)。CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，未感染的U251細(xì)胞下調(diào)BST-2表達(dá)后增殖活性下降，但相對于對照組和shNC組，差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義；HCMV感染U251細(xì)胞后增殖活性明顯增加，下調(diào)BST-2后可使細(xì)胞增殖活力明顯下降(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C)。

圖4 HCMV感染后下調(diào)BST-2對U251細(xì)胞增殖的影響Fig.4 The influence on cell proliferation after down-regulation of BST-2 in HCMV infected U251 cellsA:BST-2蛋白表達(dá)情況；B:BST-2蛋白表達(dá)量統(tǒng)計學(xué)分析；C:下調(diào)BST-2對U251細(xì)胞增殖的影響；**：相對于shNC組，P<0.05下圖同A:The expression of BST-2 protein; B:Statistical analysis of the expression of BST-2 protein; C:Effect of down-regulation of BST-2 on cell proliferation；**：compared with shNC group，P<0.05

2.5 HCMV感染后下調(diào)BST-2表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

為檢測BST-2是HCMV感染促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的關(guān)鍵蛋白，分別用細(xì)胞劃痕和tanswell方法進(jìn)行了驗證。將U251細(xì)胞不感染或感染HCMV(MOI=1)后，分別轉(zhuǎn)染siBST-2-171、siBST-2-256、shNC或不做處理，細(xì)胞劃痕24 h后倒置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，相對于對照組，HCMV感染U251細(xì)胞后劃痕距離明顯縮短，說明HCMV感染可以促進(jìn)U251細(xì)胞遷移，而下調(diào)BST-2的siBST-2-171組和siBST-2-256組細(xì)胞劃痕距離明顯寬于HCMV組和HCMV感染后轉(zhuǎn)染shNC組(P<0.05)，而與對照組相比差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明下調(diào)BST-2表達(dá)可以抑制由HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移(圖5)。Tanswell遷移試驗得出了相似的結(jié)果(圖6)，相對于未感染組，HCMV感染組細(xì)胞，穿膜數(shù)目增多，下調(diào)BST-2后，細(xì)胞穿膜遷移能力顯著下降(P<0.01)。

圖5 HCMV感染后下調(diào)BST-2對U251細(xì)胞劃痕愈合的影響Fig.5 The influence on cell scratch wound healing after down regulation BST-2 in HCMV infected U251 cells

圖6 下調(diào)BST-2后的U251細(xì)胞Transwell遷移情況Fig.6 The influence on cell migration after down regulation BST-2 in HCMV infected U251 cells

3 討 論

HCMV感染與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞關(guān)系密切，其在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用機(jī)制成為近年研究的熱點。2002年,Cobbs等[1]率先報道在Ⅱ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織中可以檢測到HCMV基因和蛋白。隨后陸續(xù)有研究顯示90%以上膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(膠質(zhì)瘤IV級)組織中可檢測到HCMV基因組和蛋白質(zhì)，80%的患者血清學(xué)樣本中檢出HCMV標(biāo)志物[2]，HCMV感染與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)[3]。但HCMV感染參與膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制至今尚不明確。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實HCMV可以在U251細(xì)胞內(nèi)建立感染，并能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移，表明其在膠質(zhì)瘤的發(fā)展過程中起到重要作用。

盡管BST-2被認(rèn)為是拮抗包膜病毒釋放宿主細(xì)胞限制因子，但是最新研究表明在多種腫瘤內(nèi)均高表達(dá)BST-2，如頭頸部腫瘤[12]、肺癌[13]、乳腺癌[11，14]、宮頸癌[15]、骨髓瘤、子宮內(nèi)膜癌[16]等，提示BST-2有致癌作用。本研究證實HCMV感染可促進(jìn)BST-2表達(dá)，并在一定時間內(nèi)呈時間依賴關(guān)系，鑒于BST-2與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，推測BST-2可能在HCMV促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性發(fā)展中具有重要作用，也許是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個促進(jìn)因素。我們隨后篩選了干擾靶點，有效阻斷了HCMV感染引起的BST-2水平上調(diào)。通過CCK-8細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞劃痕愈合和transwell方法檢測HCMV感染后下調(diào)BST-2對U251細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，證實了HCMV感染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞后可促使U251細(xì)胞惡性增殖和遷移，而對BST-2進(jìn)行干擾抑制后可有效抑制其增殖和遷移能力。本研究結(jié)果在一定程度上詮釋了HCMV感染促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的一個可能的機(jī)制，BST-2也許會成為膠質(zhì)瘤癌癥治療的新靶點。

BST-2改變膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的機(jī)制尚未明確。BST-2抗病毒機(jī)制是其通過GPI區(qū)與病毒包膜結(jié)合，通過TM區(qū)固定在細(xì)胞膜上，并促進(jìn)病毒子通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的早胞內(nèi)體繼而被溶酶體酶降解，最終達(dá)到抑制病毒釋放的作用[17]。BST-2可能是通過類似的機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞粘附和浸潤細(xì)胞外基質(zhì)，也可能是通過激活NF-kB介導(dǎo)的信號通路[18]，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞因子等從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移和浸潤，有待進(jìn)一步的研究去證實。

參考文獻(xiàn):

[1] Cobbs CS, Harkins L, Samanta M,et al．Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma[J]. Cancer Res，2002, 62(12):3347-3350.

[2] Mitchell DA, Xie W, Schmittling R,et al．Sensitive detection of human cytomegalovirus in tumors and peripheral blood of patients diagnosed with glioblastoma[J]. Neuro Oncol，2008, 10(1):10-18.

[3] Scheurer ME, Bondy ML, Aldape KD,et al．Detection of human cytomegalovirus in different histological types of gliomas[J]. Acta Neuropathol，2008, 116(1):79-86.

[4] Wang X, Hu M, Xing F,et al．Human cytomegalovirus infection promotes the stemness of U251 glioma cells[J]. J Med Virol，2016, 89:878-886.

[5] Kupzig S, Korolchuk V, Rollason R,et al．Bst-2/HM1.24 is a raft-associated apical membrane protein with an unusual topology[J]. Traffic，2003, 4(10):694-709.

[6] Van Damme N, Goff D, Katsura C,et al．The interferon-induced protein BST-2 restricts HIV-1 release and is downregulated from the cell surface by the viral Vpu protein[J]. Cell Host Microbe，2008, 3(4):245-252.

[7] Sarojini S, Theofanis T, Reiss CS.Interferon-induced tetherin restricts vesicular stomatitis virus release in neurons[J]. DNA Cell Biol，2011, 30(12):965-974.

[8] Lv M,Zhang B,Shi Y,et al.Identification of BST-2/tetherin-induced hepatitis B virus restriction and hepatocyte-specific BST-2 inactivation[J]. Sci Rep，2015, 5(714):11736.

[9] Viswanathan K, Smith MS, Malouli D, et al.BST2/Tetherin enhances entry of human cytomegalovirus[J]. PLoS Pathog，2011, 7(11):e1002332.

[10] Mukai S, Oue N, Oshima T,et al.Overexpression of Transmembrane Protein BST2 is Associated with Poor Survival of Patients with Esophageal, Gastric, or Colorectal Cancer[J]. Ann Surg Oncol，2017, 24(2):594-602.

[11] Mahauad-Fernandez WD, DeMali KA, Olivier AK,et al.Bone marrow stromal antigen 2 expressed in cancer cells promotes mammary tumor growth and metastasis[J]. Breast Cancer Res，2014, 16(6):493.

[12] Fang KH, Kao HK, Chi LM,et al. Overexpression of BST2 is associated with nodal metastasis and poorer prognosis in oral cavity cancer[J]. Laryngoscope，2014, 124(9):E354-360.

[13] Wang W, Nishioka Y, Ozaki S,et al. HM1.24 (CD317) is a novel target against lung cancer for immunotherapy using anti-HM1.24 antibody[J]. Cancer Immunol Immunother，2009, 58(6):967-976.

[14] Mahauad-Fernandez WD, Borcherding NC, Zhang W,et al.Bone marrow stromal antigen 2 (BST-2) DNA is demethylated in breast tumors and breast cancer cells[J]. PLoS One，2015, 10(4):e0123931.

[15] Milutin Gasperov N, Farkas SA, Nilsson TK,et al.Epigenetic activation of immune genes in cervical cancer[J]. Immunol Lett，2014, 162(2PtB):256-257.

[16] Yokoyama T, Enomoto T, Serada S,et al.Plasma membrane proteomics identifies bone marrow stromal antigen 2 as a potential therapeutic target in endometrial cancer[J]. Int J Cancer，2013, 132(2):472-484.

[17] Mahauad-Fernandez WD.The role of BST-2/Tetherin in host protection and disease manifestation[J]. Immun Inflamm Dis，2016, 4(1):4-23.

[18] Matsuda A, Suzuki Y, Honda G,et al.Large-scale identification and characterization of human genes that activate NF-kappaB and MAPK signaling pathways[J]. Oncogene，2003, 22(21):3307-3318.