燈心草抑制RANKL誘導的破骨細胞形成

王鵬，郭狄，陳利華，章禮煒，陳海嘯

破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成之間的平衡是維持骨骼穩(wěn)定的必要條件［1］。長期過量的骨吸收破壞了這種平衡，導致骨質(zhì)疏松癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎［2］、人工關(guān)節(jié)無菌性松動、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等病理性骨損失［2］。由于破骨細胞的形成和功能增強引起過度骨吸收是產(chǎn)生這些溶骨性病變的主要原因之一，因此通過抑制破骨細胞的形成可有效防治這些溶骨性疾病。雙膦酸鹽可有效抑制破骨細胞活性［3］，但其使用會產(chǎn)生發(fā)熱、骨痛、頜骨壞死［4］、不典型骨折［5］等不良反應，因此尋找新的具有抗骨丟失作用的替代藥物仍然具有很大的價值?；诖耍緦嶒炌ㄟ^研究燈心草對核因子（NF）-κB受體活化因子配體（RANKL）誘導破骨細胞形成的抑制作用，為尋找新型抗溶骨性疾病的藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡清潔級雄性C57/BL6小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［許可證號碼：SCXK（滬）2013-0016］。

1.2 實驗試劑和儀器 燈心草（提取物，粉劑）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；RANKL和可溶性小鼠巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）購自R&D公司；青鏈霉素、胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基均購自Hyclone公司；TRAP染色試劑盒購自Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RT-PCR所需的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher公司。Mulitiskan FC型酶標儀、倒置熒光顯微鏡（Leica DMIL LED），7500實時熒光定量PCR儀（ABI StepOne plus），高速低溫離心機（Thermo Fisher）。

1.3 骨髓巨噬細胞（BMMs）的獲取 取8周齡雄性C57/BL6小鼠，3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉、75%乙醇浸泡消毒，在超凈臺中分離取出小鼠的股骨和脛骨，PBS沖洗后更換器械，用血管鉗夾住股骨和脛骨，然后用1 mL注射器在股骨脛骨兩端各戳一個洞，用1 mL注射器吸取α-MEM沖洗出股骨和脛骨中的骨髓。加入含30 μg/L的M-CSF的完全培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，去上清液更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)BMMs至細胞密度達到90%。

1.4 細胞增殖實驗 消化1.3中的BMMs，按照8×103個/孔接種在2塊96孔板中，每板接種30個孔。培養(yǎng)24 h，待BMMs細胞完全貼壁后，加入含不同濃度（0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）燈心草的完全培養(yǎng)基，每個濃度設置3個復孔，隔天換液1次，分別培養(yǎng)48 h、96 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，混勻后在37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm波長處測得光密度（OD）值，并計算BMMs 48 h、96 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.5 BMMs培養(yǎng)及破骨細胞分化 取8周齡雄性C57BL6小鼠，重新獲取BMMs（如前所述）。消化分離后接種于96孔板中。設不同濃度（0、6.25、12.5、25 μmol/L）燈心草組，每組3個復孔，細胞密度為8×103個/孔。在30 μg/L M-CSF配成的完全培養(yǎng)基中培育24 h，待細胞完全貼壁后加入30 μg/L MCSF、50 μg/L RANKL和（0、6.25、12.5、25 μmol/L）燈心草配成的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，隔天換液1次，直到觀察到成熟的破骨細胞形成。棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次后，加入4%多聚甲醛固定20 min。加入TRAP染色試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育染色，直至觀察到0 μmol/L燈心草組明顯著色。將TRAP染色陽性且細胞核超過3個的細胞定義為破骨細胞，在40倍顯微鏡下觀察，并記錄96孔板中每孔的破骨細胞數(shù)目。

1.6 RT-PCR檢測破骨細胞特異性基因的表達 消化分離1.3中的BMMs細胞，接種于6孔板中，細胞密度為1×105個/孔，細胞分組同1.5。48 h換液1次，培養(yǎng)4～5 d，當?shù)怪蔑@微鏡中觀察到0 μmol/L燈心草組中出現(xiàn)多核巨細胞時終止培養(yǎng)。加入1 mL TRIzol提取總RNA，測定OD260/280。取1 μg RNA 樣本，1 μL Oligo（dT）18primer ，加入 ddH2O 至 12 μL，65 ℃ 反應 5 min；再 加入 4 μL 5× Reaction Buffer、1 μL RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）、2 μL 10 mmol/L dNTP Mix、1 μL RevertAid M-MulV RT（200 U/μL）；反應條件為42℃ 60 min，70℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-70℃的超低溫冰箱中。取1 μL cDNA模板，8.5 μL ddH2O，分別為0.5 μL的上、下游引物，10 μL SYBR Green；反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。并采用2-ΔΔCt法分析降鈣素受體（CTR）、活化 T 細胞核因子 1（NFATC1）、空泡型H+三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運酶-d2（V-ATPased2）、空泡型H+三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運酶-a3（V-ATPase-a3）、CFOS等基因的mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參基因，重復3次。基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度燈心草對BMMs增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，藥物濃度低于12.5 μmol/L時，燈心草對BMMs增殖無明顯抑制作用，當燈心草濃度≥25 μmol/L時，其對BMMs開始有毒性作用，且隨著濃度的升高，毒性作用逐漸增強，見圖1。48 h和96 h時燈心草藥物作用于BMMs的IC50分別為69.51 μmol/L和55.68 μmol/L。

Tab.1 Primers for RT-PCR表1RT-PCR引物序列表

Fig.1 The effects of 0-200 μmol/L of Juncus effuses on proliferation of BMMs cells圖1 不同濃度燈心草對BMMs細胞增殖的影響

2.2 不同濃度燈心草對RANKL誘導的破骨細胞形成的影響 在RANKL的刺激下，0 μmol/L燈心草組中可見BMMs形成大量的TRAP染色陽性的多核巨細胞，即成熟的破骨細胞；在不同濃度的燈心草作用下，TRAP染色陽性的多核巨細胞明顯減少，并且隨著藥物濃度的升高，破骨細胞數(shù)目逐漸減少，見圖2。

Fig.2 The effects of different concentrations of Juncus on RANKL-induced osteoclastogenesis圖2 不同濃度燈心草對RANKL誘導的破骨細胞形成的影響

2.3 不同濃度燈心草對破骨細胞特異性基因表達的影響 結(jié)果顯示，與0 μmol/L燈心草組相比，6.25、12.5、25 μmol/L燈心草可顯著抑制破骨細胞特異性基因的表達，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。見圖3。

3 討論

3.1 破骨細胞增多是導致骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一 骨質(zhì)疏松癥是一種無聲的疾病，很多人直到發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折時才發(fā)現(xiàn)［6］。骨質(zhì)疏松性骨折嚴重影響患者健康，給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。破骨細胞數(shù)目增加和骨吸收活性增強是導致骨質(zhì)疏松癥等疾病發(fā)生的主要原因［7］。研究表明，RANKL和破骨細胞表面的受體RANK結(jié)合是破骨細胞形成的重要因素［8］，其相互結(jié)合后迅速激活多個不同的信號通路介導的蛋白激酶，參與破骨細胞的形成。如MAPK信號通路的活化可誘導機體產(chǎn)生NFATC1等轉(zhuǎn)錄因子［9］，進而誘導破骨細胞形成［10-11］。另外，P38信號通路蛋白的磷酸化也可促進NFATC1蛋白的產(chǎn)生［12］。RANKL誘導的破骨細胞分化過程中會促進轉(zhuǎn)錄因子NFATC1的過表達，然而即使沒有RANKL的刺激，NFATC1轉(zhuǎn)錄因子的過表達也能誘導破骨細胞的形成［7］。因此，RANKL激活NFATC1基因的過表達是促進破骨細胞分化、增強其骨吸收活性的關(guān)鍵因素之一［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，CTR是破骨細胞上最早發(fā)現(xiàn)的一種受體，為破骨細胞的特征性標志之一［14］。另有研究表明，V-ATPase位于骨和破骨細胞的質(zhì)膜，其作用是促進氫離子的產(chǎn)生，從而增強破骨細胞的骨吸收能力［15］。因此，研究藥物抑制RANKL誘導的破骨細胞形成、骨吸收功能及其機制，可以為治療骨質(zhì)疏松癥等溶骨性疾病提供可靠的依據(jù)。

Fig.3 The effects of different concentrations of Juncus on expression levels of CTR,NFATC1,V-ATPase-a3,V-ATPase-d2 and C-FOS mRNA圖3 不同濃度燈心草對破骨細胞分化過程中CTR、NFATC1、V-ATPase-a3、V-ATPase-d2及C-FOS mRNA表達的影響

3.2 燈心草對破骨細胞形成的抑制作用 我國醫(yī)學發(fā)展的研究表明，中草藥可以有效治療多種慢性疾?。?6］。有研究發(fā)現(xiàn)，燈心草提取物可以有效抑制脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導的炎癥反應，具有良好的抗炎效果［17］。本研究通過CCK-8實驗篩選出燈心草對BMMs無明顯毒性的濃度，用于探索其對破骨細胞分化的影響。通過記錄TRAP染色陽性的多核巨細胞的數(shù)目來評價燈心草對破骨細胞形成的影響，結(jié)果顯示燈心草可顯著抑制破骨細胞的形成，并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。此外，研究發(fā)現(xiàn)燈心草可顯著抑制破骨細胞特異性基因CTR、NFATC1、V-ATPase-d2、V-ATPase-a3、C-FOS 等mRNA的表達，并且呈現(xiàn)了一定的濃度依賴性。由此進一步證明燈心草對破骨細胞形成的抑制作用，其機制可能是通過抑制破骨細胞形成中特異性基因的表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，燈心草可顯著抑制破骨細胞的形成及其特異性基因的表達。本研究結(jié)果可能預示了燈心草在預防及治療骨質(zhì)疏松癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、人工關(guān)節(jié)無菌性松動等溶骨性疾病具有潛在的價值，但其作用于破骨細胞的明確靶點和臨床應用方式仍然需要進一步研究。

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