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    NEDD9表達(dá)變化與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性表型及不良預(yù)后的關(guān)系

    2018-07-02 07:13:34姜紅升周彩鳳王艷洲邢曉鋒于金然
    關(guān)鍵詞:低度膠質(zhì)瘤腦組織

    姜紅升,周彩鳳,王艷洲,邢曉鋒,于金然

    (1.滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外四科;2.滄州市中心醫(yī)院教學(xué)處,河北 滄州 061000)

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤,也是中樞系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,可占到顱內(nèi)腫瘤的一半左右,常在功能區(qū)呈浸潤性生長[1]。臨床上,常采用手術(shù)、放化療或綜合治療等手段對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行治療,以手術(shù)為主要治療手段,但手術(shù)治療很難一次性徹底完整切除,尤其對(duì)惡性程度高的神經(jīng)膠質(zhì)瘤,其預(yù)后仍不理想,復(fù)發(fā)率較高,患者生存期較短[2]。神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)基因9(NEDD9)屬于一種局灶性粘附骨架蛋白,最早在期胚胎小鼠的大腦組織中被發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移及凋亡中起重要作用,在調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物,控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、趨化、調(diào)亡、細(xì)胞周期和分化中起重要的作[3]。相關(guān)研究[4]表明,NEDD9的高表達(dá)與大腦膠質(zhì)瘤、皮膚黑色素瘤及乳腺癌等多種腫瘤的不良預(yù)后有密切關(guān)系。本研究通過分析NEDD9表達(dá)變化與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性表型及不良預(yù)后的關(guān)系,為尋找膠質(zhì)瘤新標(biāo)志物奠定基礎(chǔ),為臨床客觀、準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2010年10月至2012年10月滄州市中心醫(yī)院收治的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者100例作為研究對(duì)象,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];(2)患者均為首次手術(shù)治療,Ⅲ~Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后給予替莫唑胺輔助化療;(3)術(shù)前未接受放化療;(4)簽署知情同意書。根據(jù)病理診斷惡性程度分為低度惡性組(WHO分級(jí)為Ⅰ~Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤)和高度惡性組(WHO 分級(jí)為Ⅲ~Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤),每組各50例,同時(shí)收集因重度顱腦外傷患者50例作為對(duì)照組。低度惡性組中:男性32例,女性18例,年齡30~68歲,平均(46.24±6.82)歲;高度惡性組中:男性33例,女性17例,年齡32~67歲,平均(45.85±7.36)歲;正常對(duì)照組中:男性30例,女性20例,年齡30~69歲,平均(46.16±7.35)歲。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批并通過。

    1.2 方法

    1.2.1 樣本采集 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤標(biāo)本,對(duì)照組行內(nèi)減壓而切除的腦組織,置入液氮中冰凍,并存放于-80℃冰箱備存,所有標(biāo)本都用石蠟包埋。

    1.2.2 免疫組化法檢測NEDD9表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)方法觀測腦組織標(biāo)本中NEDD9的表達(dá),使用切片機(jī)(德國Leica公司)將石蠟包埋組織切成4 μm厚度,二甲苯液脫蠟后依次采用95%、90%、85%乙醇水化,蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μL,20 ℃下孵育10 min, PBS沖洗3次,加入50 μL的一抗4 ℃下過夜后,加入二抗20 ℃下孵育10 min,采用DBA試劑盒(美國KPL公司)中的試劑進(jìn)行顯色,放入顯微鏡下觀察,顯色后用蒸餾水洗掉,終止顯色,采取蘇木素復(fù)染2 min,中性樹膠封片。

    1.2.3 NEDD9 mRNA及蛋白表達(dá)檢測 采用qRT-PCR技術(shù)檢測腦組織NEDD9 mRNA的表達(dá):(1)從冰箱中取出標(biāo)本組織20 mg,研磨成粉末狀;(2)嚴(yán)格按照Trizol試劑(美國 Invitrogen 公司)說明書提取組織總RNA;(3)采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)配置反應(yīng)混合物,反轉(zhuǎn)錄合成環(huán)狀DNA;(4)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s, 60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),相關(guān)引物序列(上海生工公司)見表1;(5)PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色和2%瓊脂糖凝膠電泳后,采用紫外分析儀進(jìn)行觀察,并采用HMIAS-2000系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,用NEDD9 mRNA與GAPDH的灰度比值表示NEDD9 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。采用Western-blot法檢測腦組織NEDD9蛋白的表達(dá):(1)采用改良異硫氰酸胍法提取腦組織總蛋白,-70℃下凍存;(2)將40 μg總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白;(3)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC膜)上;(4)NC膜置入封閉液中振蕩封閉30 min(室溫20℃),漂洗3次(每次30 min)后加入NEDD9抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋液搖勻后,采用免疫熒光增強(qiáng)法(ECL)試劑盒(北京普利萊基因有限公司)檢測NEDD9蛋白的表達(dá),同樣的方法檢測β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。

    表1 NEDD9與GAPDH引物序列表

    1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)腦組織的NEDD9蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測,以陽性細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的比率和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:(1)0分:無陽性細(xì)胞;(2)1分:陽性細(xì)胞百分比<5%;(3)2分:5%<陽性細(xì)胞百分比≤20%。(4)3分:陽性細(xì)胞百分比>20%;對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:(1)0分:無染色;(2)1分:淡黃色;(3)2分:棕黃色;(4)3分:棕褐色。將兩者的評(píng)分相乘得到總分,并將總分>4分定義為高表達(dá),總分≤4分定義為低表達(dá)[6]。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 免疫組織化學(xué)法結(jié)果比較

    免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對(duì)照組的腦組織中NEDD9蛋白的表達(dá)極低,在低度惡性組和高度惡性組中NEDD9表達(dá)較高,且高度惡性組明顯高于低度惡性組(圖1)。免疫組織化學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示,對(duì)照組、低度惡性組和高度惡性組的NEDD9蛋白評(píng)分為1.89±0.42、3.12±1.03、8.12±1.03,對(duì)照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05)。

    2.2 各組NEDD9 mRNA及蛋白表達(dá)情況

    RT-PCR結(jié)果顯示,對(duì)照組、低度惡性組和高度惡性組的NEDD9 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.23±0.07、0.42±0.08、0.79±0.12,對(duì)照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05);Western-blot結(jié)果顯示,見圖2。

    2.3 患者5年生存情況比較

    NEDD9高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間為26.35個(gè)月(95%CI 20.15~29.94),NEDD9低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間39.94個(gè)月(95%CI 32.25~46.38),低表達(dá)組5年生存時(shí)間明顯高于高表達(dá)組(χ2=9.876,P<0.001),見圖3。

    2.4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者5年總生存時(shí)間的相關(guān)因素分析

    多因素COX回歸分析顯示,惡性程度(HR=1.936,P=0.007)、腫瘤全切除(HR=1.073,P=0.018)、NEDD9蛋白表達(dá)(HR=2.415,P=0.009)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者5年總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表2。

    表2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者5年總生存時(shí)間COX回歸分析

    因素HR95%CIP值年齡(<60歲/≥60歲)1.1230.675~1.9520.107性別(男/女)0.7530.207~0.9590.153腫瘤部位1.3151.106~3.8540.348惡性程度(低/高)1.9361.396~3.5420.007腫瘤全切除1.0731.005~2.2120.018NEDD9蛋白表達(dá)(低/高)2.4151.103~5.3470.009

    3 討論

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤屬于臨床最常見的腦腫瘤,是起源于膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)外胚層腫瘤,通常生長部位較深,且呈浸潤性的生長,具有難以治愈、病程短、患者生存質(zhì)量差及死亡率高的特點(diǎn)[7]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床主要表現(xiàn)為:頭痛、惡性嘔吐、神經(jīng)功能缺失、視乳頭水腫、偏癱、精神性格改變及共濟(jì)失調(diào)等,易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[8]。目前對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤首選的治療手段為手術(shù)切除,但術(shù)后半年左右易復(fù)發(fā),此時(shí)患者神經(jīng)功能損傷加重,神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞范圍擴(kuò)大,患者意識(shí)水平下降,最終誘發(fā)腦功能衰竭進(jìn)而發(fā)生死亡[9]。惡性程度高的患者預(yù)后極差,其平均中位生存期通常約一年左右[10]。

    上個(gè)世紀(jì)90年代初,NEDD9首次被提出,其又稱Cas-L,屬于骨架蛋白的CAS家族蛋白成員,在介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用[11]。NEDD9在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起作用,其可與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路(BCAR3、CHAT-H、AND-34等)發(fā)生作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞趨化、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本研究經(jīng)免疫組織化學(xué)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對(duì)照組腦組織中NEDD9蛋白的表達(dá)極低,在低度惡性組和高度惡性組中NEDD9表達(dá)較高,尤其在高度惡性膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),這是因?yàn)镹EDD9是前致癌基因FAK激酶的特異性效應(yīng)分子,其通過對(duì)蛋白復(fù)合體(Fascin蛋白)進(jìn)行調(diào)節(jié),調(diào)控細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲、凋亡及細(xì)胞周期,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷徙及侵襲。高表達(dá)的NEDD9可導(dǎo)致Fascin蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)性重組,促使應(yīng)力纖維性結(jié)構(gòu)形成,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞骨架重塑,破壞細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的正常粘附性,使細(xì)胞粘附性下降,細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng),隨著NEDD9持續(xù)的高表達(dá),最終膠質(zhì)瘤惡性演變[13-14]。

    本研究經(jīng)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NEDD9 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量在各種的表達(dá)為:對(duì)照組<低度惡性組<高度惡性組(P<0.05),這說明了NEDD9 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性演變有關(guān),在正常腦組織中其表達(dá)很微弱,隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性的遞進(jìn)而呈上調(diào)趨勢,且在高度惡性膠質(zhì)瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)。NEDD9會(huì)提高與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖,當(dāng)NEDD9呈高表達(dá)時(shí),會(huì)激活一些下游效應(yīng)分子(氨基端激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶及絲裂原激活的蛋白激酶等),從而促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲,同時(shí)NEDD9也會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的金屬蛋白酶 2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP-9),而MMP-2或MMP-9會(huì)降解細(xì)胞基質(zhì),進(jìn)一步增加生長因子及細(xì)胞因子的作用,促進(jìn)惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。因此臨床上可通過基因靶向治療下調(diào)NEDD9 的表達(dá)水平來削弱腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,阻斷或延緩神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性演變進(jìn)程。

    本研究通過對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響因素進(jìn)行分析,Cox回歸多因素分析結(jié)果顯示,NEDD9蛋白表達(dá)(HR=2.415,P=0.009)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者5年總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),膠質(zhì)瘤生存率會(huì)隨其惡性程度的升高而降低,這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相一致,是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,并意味著NEDD9可能是一個(gè)有用的神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)志物,可作為一個(gè)獨(dú)立的患者預(yù)后指標(biāo)。

    綜上所述,NEDD9表達(dá)程度與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,在膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展中扮演重要角色,NEDD9高表達(dá)可預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者長期不良預(yù)后。

    [1] Ostrom QT,Bauchet L,Davis FG,etal.The epidemiology of glioma in adults:a “state of the science” review[J].Neuro-oncology,2014,16(7):896.

    [2] Stummer W.Fluorescein in brain metastasis and glioma surgery[J].Acta Neurochirurgica,2015,157(12):2199-2200.

    [3] Kozyulina PY,Loskutov YV,Kozyreva VK,etal.Pro-metastatic NEDD9 regulates individual cell migration via caveolin-1-dependent trafficking of integrins[J].Molecular Cancer Research Mcr,2015,13(3):423.

    [4] Shagisultanova E,Gaponova AV,Gabbasov R,etal.Preclinical and clinical studies of the NEDD9 scaffold protein in cancer and other diseases[J].Gene,2015,567(1):1-11.

    [5] 韓蘇陽,張佩佩.DCE-MRI在腦腫瘤臨床診治中的應(yīng)用進(jìn)展[J].浙江醫(yī)學(xué),2016,38(17):1468-1470.

    [6] Jagadish N,Parashar D,Gupta N,etal.A novel cancer testis antigen target A-kinase anchor protein (AKAP4) for the early diagnosis and immunotherapy of colon cancer[J].Oncoimmunology,2016,5(2):e1078965.

    [7] Karunamuni R,Bartsch H,White NS.Dose-Dependent Cortical Thinning After Partial Brain Irradiation in High-Grade Glioma. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics,2016,94(2):297.

    [8] Paw I,Carpenter RC,Watabe K,etal.Mechanisms regulating glioma invasion[J].Cancer Letters,2015,362(1):1-7.

    [9] Pang C,Guan Y,Zhao K,etal.Up-regulation of microRNA-15b correlates with unfavorable prognosis and malignant progression of human glioma[J].International Journal of Clinical & Experimental Pathology,2015,8(5):4943.

    [10] 范英俊,劉艷輝.貝伐單抗在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2013,12(3):281-283.

    [11] Iida J,Dorchak J,Clancy R,etal.Role for chondroitin sulfate glycosaminoglycan in NEDD9-mediated breast cancer cell growth[J].Experimental Cell Research,2015,330(2):358.

    [12] Han T,Yi XP,Liu B O,etal.MicroRNA-145 suppresses cell proliferation,invasion and migration in pancreatic cancer cells by targeting NEDD9[J].Molecular Medicine Reports,2015,11(6):4115-4120.

    [13] Ahmed HH,Abdrabou AA,Hassan AZ,etal.Phytochemical Analysis and Anti-cancer Investigation of Bswellia serrata Bioactive Constituents In Vitro[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp,2015,16(16):7179-7188.

    [14] Feng J,Zhao J,Xie H,etal.Involvement of NEDD9 in the invasion and migration of gastric cancer[J].Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine,2015,36(5):3621.

    [15] Kalhori V,T?rnquist K.MMP2 and MMP9 participate in S1P-induced invasion of follicular ML-1 thyroid cancer cells[J].Molecular & Cellular Endocrinology,2015,404(C):113.

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