Hedgehog信號通路中PTCH1和GLI1蛋白在肝內(nèi)膽管細胞癌組織中的表達及診斷價值

國麟祺,陳 穎,滕欣麗,夏偉濱,徐 劍,曲義坤*

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院 1.普外二科;2.重癥醫(yī)學科；3.放療二科，黑龍江 佳木斯154003)

肝內(nèi)膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma ，ICC)占消化道腫瘤的3%，侵襲性強，惡性程度最高，死亡率高，預后差，近年來發(fā)病率逐漸上升[1]。Hh信號通路在胚胎發(fā)育過程中起著至關重要的作用，腫瘤中Hh通路的是異?；钴S的，在ICC參與了腫瘤細胞的增殖與遷移，Ptch1和GLI1蛋白呈高表達狀態(tài)[2]。本研究擬檢測Ptch1和GLI1蛋白在癌組織中的表達情況，分析其與ICC病理相關性，擬提高診療水平，尋找靶向治療的新途徑，改善患者預后。

1 資料與方法

1.1一般資料收集我院2014年1月-6月62例ICC患者的新鮮癌組織和癌旁邊緣5 cm處正常組織標本。其中男37例，女25例；年齡29-74歲，平均年齡(54.37±6.52)歲。所有患者術(shù)前均未進行治療，均簽署知情同意書，符合醫(yī)學倫理要求。

1.2主要試劑武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)的一抗兔抗人GLI1抗體，北京萬域美瀾科技有限公司生產(chǎn)的羊抗人Ptch1抗體，江蘇綠葉有限公司生產(chǎn)的免疫組化SP試劑盒。

1.3檢測方法[3]患者新鮮癌組織和癌旁正常組織標本，用10%福爾馬林固定，經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯處理的細胞石蠟包埋切片，脫蠟、水化，PBS洗3次，物理修復，滴加一滴二種抗體在切片上，工作濃度均為1∶200，滴人后置于4℃冰箱過夜，進行HE染色和免疫組化染色。PBS洗三遍，為一抗陰性對照，陽性對照片應用兩張試劑公司的陽性片子。

1.4結(jié)果判定[4]Ptch1于細胞膜和細胞漿表達，陽性為棕黃色；GLi1細胞漿表達，陽性為深棕黃色。隨機5個視野，顯微鏡下計數(shù)1000個細胞，染色細胞超過10%為陽性；染色細胞超過50%為高表達。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0軟件，計數(shù)資料采用率(%)表示，采用χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義時P<0.05。

2 結(jié)果

2.1HE結(jié)果癌旁組織見圓形等規(guī)則形狀，纖維增生少見。癌細胞核濃染，形狀雜亂，細胞質(zhì)淡染或嗜堿性，膽管黏膜下層浸潤，膽管壁增厚，向外浸潤。

2.2蛋白表達結(jié)果Ptch1和GLI1蛋白在ICC組織中均呈高表達，高于癌旁組織(79.03%vs16.13%)(90.32%vs12.90%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 Ptch1和GLI1的陽性表達情況[n%]

2.3蛋白表達與ICC病理相關性Ptch1和GLI1蛋白的表達與腫瘤TNM分期、是否轉(zhuǎn)移、是否侵潤、分化程度以及生存時間有關(P<0.05)。見表2。

3 討論

肝內(nèi)膽管細胞癌是指發(fā)生在肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，肝門部位最為多見，發(fā)生隱匿、發(fā)展迅速，嚴重威脅患者的生命安全。傳統(tǒng)手術(shù)難以達到根治性切除的肝門區(qū)域的腫瘤，復發(fā)率與死亡率均居高不下。從基因水平分析ICC發(fā)生發(fā)展的作用機制，鑒定明確的靶標基因，對ICC進行早期診斷、預防和臨床靶向治療具有重要意義[5]。

表2 蛋白表達與ICC臨床病理特征關系%]

Hh信號通路是一條調(diào)控胚胎細胞生長分化重要的通路[6]，參與多種器官和組織的發(fā)育、血管新生及炎癥修復等，可促進上皮細胞轉(zhuǎn)化間質(zhì)細胞，胚胎停止發(fā)育后，相關蛋白被抑制，Hh信號通路關閉，進入失活狀態(tài)。通路激活是指Ptch跨膜受體與Hedgehog配體結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子GlIl，促進眾多基因的轉(zhuǎn)錄，如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、染色體形成、腫瘤血管生成等，調(diào)節(jié)細胞生成、增殖和凋亡[7]。Hh信號通路的異常激活在許多腫瘤中體現(xiàn)，如基底細胞癌(BCC)、橫紋肌肉瘤(RMS)、乳腺癌(BC)、宮頸癌(CC)、前列腺癌(PCa)、髓母細胞瘤(MB)、胃癌(SC)、肝癌(HCC)、肺癌(LC)、食道癌(EC)。

膽管癌的發(fā)生、發(fā)展與Hh信號通路異常激活有關，ICC7種細胞系均表達Ptch1，還有多數(shù)細胞系表達GLI1[8]，Hh信號的目的基因是Ptch1，Ptch1是受體也是重要的負反饋調(diào)節(jié)因子；GLI1作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，起著重要的不可替代的調(diào)控作用，Ptch1與GLI1兩種蛋白表達水平反映了Hh信號通路的活化水平[9]，二者的表達水平增高提示Hh信號通路的活化水平顯著增高，在惡性腫瘤中都存在Hh信號通路異常激活，以及Ptch1與GLI1的過度表達[10]。其作用機制為GLI1誘導Bcl-2因子的表達以抑制其凋亡，或者誘導G0/S期細胞表達以促進其增殖；GLI1促進上皮組織向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的細胞因子活化，引起癌細胞轉(zhuǎn)移淋巴、血液，促進腫瘤向遠處侵襲[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在ICC組織中Ptch1和GLI1的表達率均顯著高于癌旁組織(79.03%vs16.13%)(90.32%vs12.90%)，提示ICC的發(fā)生、發(fā)展與二者的高表達有關，與過高的Hh信號通路活化水平有關。二者的表達與腫瘤分化程度、手術(shù)方式、轉(zhuǎn)移狀況、TNM分期以及生存時間均具有相關性，根治性治療的兩種蛋白表達率要低于姑息性手術(shù)患者，二者蛋白表達率越高，腫瘤TNM分期越高，分化水平越低，腫瘤向遠處侵襲能力越強，生物學行為更差，生存期更短[12]。說明Hh信號通路異常激活，Ptch1調(diào)控GLI1的高表達，促進腫瘤細胞的生成、增殖、侵襲，高活化水平的Hh信號通路在ICC的發(fā)生發(fā)展中起著不可缺少的調(diào)控作用。

綜上所述，Hh信號通路的異常激活促進腫瘤細胞的增殖與遷移，Ptch1蛋白與GLI1蛋白過表達提示預后不良，檢測二者表達結(jié)果可有效評估患者的預后，通過特異性阻斷Hh信號傳遞有望成為膽管癌治療的新靶點。

作者簡介：國麟祺(1982-)，男，主治醫(yī)師，研究生學歷，主要從事微創(chuàng)外科科研及臨床工作。

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