外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療中的意義最新進(jìn)展

劉書中，周 熹，劉 勇，王以朋

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 骨科,北京100730)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種好發(fā)于兒童及青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其發(fā)病率約為4.4/100萬，男性多于女性[1]。骨肉瘤好發(fā)于長骨干骺端，以股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端及肱骨近端最為多見。骨肉瘤惡性程度高，具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。隨著新輔助化療和放療技術(shù)的廣泛應(yīng)用，骨肉瘤患者的5年生存率可達(dá)60-70%[2]。如何利用新理論、新技術(shù)實(shí)現(xiàn)骨肉瘤患者的早期診斷及合理治療已成為臨床診療中亟待解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)有研究表明骨肉瘤的發(fā)生與基因突變、信號通路異常激活、微小RNA以及長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的異常調(diào)節(jié)等多種因素密切相關(guān)，深入研究骨肉瘤分子生物學(xué)特征對于骨肉瘤的診斷和治療亦具有重要意義[3,4]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中發(fā)現(xiàn)的長度為18-25個核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA。MiRNA可通過翻譯抑制、降解靶基因mRNA、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、介導(dǎo)ceRNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等作用機(jī)制在機(jī)體正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡的調(diào)控等，進(jìn)而發(fā)揮“促癌或抑癌”的功能[3]。近年來，研究表明多種miRNAs在骨肉瘤細(xì)胞、腫瘤組織及外周血中均存在異常表達(dá)，這些miRNAs為骨肉瘤患者的早期診斷、準(zhǔn)確診斷、微創(chuàng)診斷成為可能，并為骨肉瘤患者新型治療方案的制定提供了一定的理論支持，有望成為骨肉瘤診斷及預(yù)后判斷的新型生物學(xué)標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。本文就外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療及預(yù)后評估領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA與骨肉瘤

近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，并且miRNAs的差異表達(dá)與多種惡性腫瘤，如骨肉瘤、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌等的疾病發(fā)生、病情進(jìn)展及患者預(yù)后相關(guān)[4,5]。多項(xiàng)研究表明部分miRNAs在骨肉瘤細(xì)胞系、腫瘤組織及外周血中存在差異表達(dá)，并與OS的疾病嚴(yán)重程度、惡性表型、化療抵抗和預(yù)后密切相關(guān)，這些差異表達(dá)的miRNAs在OS疾病的衍進(jìn)過程中發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的生物學(xué)功能[4]。此外，研究者通過定量測定技術(shù)已檢測出在骨肉瘤細(xì)胞、腫瘤組織及外周血中差異表達(dá)的miRNA譜系，一定程度上揭示了miRNA與骨肉瘤疾病發(fā)生、發(fā)展的密切聯(lián)系。Hu等[6]在人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系中共檢測出268種異常表達(dá)的miRNAs，其中miR-9、miR-99、miR-195、miR-148a、miR-181a為過度表達(dá)，而miR-143、miR-145、miR-335、miR-539表達(dá)水平則呈下調(diào)趨勢。Dai等[7]研究發(fā)現(xiàn)13種miRNAs在敲除嘌呤/嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APE1)的MG-63細(xì)胞系中表達(dá)水平發(fā)生顯著改變(>2倍)，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、hsa-miR-129-5p和hsa-miR-31表達(dá)上調(diào)，而miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484則為下調(diào)，結(jié)果提示APE1是OS細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)的關(guān)鍵因子。一項(xiàng)在22種OS細(xì)胞系中建立的miRNA研究顯示高侵襲性O(shè)S細(xì)胞系中miR-199b-5p和miR-100-3p表達(dá)下調(diào)，而miR-155-5p、miR-135b-5p、miR-146a-5p水平上調(diào)，并提出miR-135b-5p和miR-146a-5p對骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力具有一定的預(yù)測價值[8]。另一項(xiàng)針對19種人OS細(xì)胞系建立的miRNA研究證實(shí)miR-9、miR-21、miR-31、miR-196a/b、miR-374a、miR-29、miR-130表達(dá)上調(diào)，miR-126、miR-486-5p、miR-150、miR-142-3p、miR-223、miR-144、miR-1、miR-195和miR-206水平下調(diào)[9]。

隨著miRNA與骨肉瘤相關(guān)性研究的逐步深入，越來越多的學(xué)者致力于骨肉瘤患者腫瘤組織、外周血中miRNA差異表達(dá)譜系的建立，如Gougelet等[10]研究表明在OS患者腫瘤組織中5種miRNAs(miR-92a、miR-99b、miR-132、miR-193a-5p、miR-422a)表達(dá)水平下調(diào)，并可有助于骨肉瘤患者臨床診斷的確立。Won等[11]利用miRNA芯片技術(shù)檢測骨肉瘤瘤體組織與癌旁組織中的miRNA表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)瘤體組織中miR-199b-5p、miR-338-3p、miR-891a、miR-10b、miR-223、miR-150、miR-451表達(dá)水平與癌旁組織相比均上調(diào)10倍以上，并通過實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)技術(shù)證實(shí)miR-199b-5p、miR-338-3p、miR-891a明顯上調(diào)。OUYANG等[12]選取40例骨肉瘤患者及相同數(shù)量健康對照者血漿標(biāo)本，應(yīng)用qRT-PCR方法測定miRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示骨肉瘤患者外周血miR-21水平顯著升高，并且高miR-21水平與高Enneking分期及化療抵抗密切相關(guān)。綜上所述，miRNAs表達(dá)水平的檢測為OS的精準(zhǔn)診斷、合理治療提供了新的研究方向和理論基礎(chǔ)，深入探討miRNAs與骨肉瘤疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性對于骨肉瘤的預(yù)后改善具有重要價值。

2 外周血miRNA檢測在骨肉瘤診斷、治療及預(yù)后評估中的意義

2.1 miRNA在外周血中的表達(dá)及檢測方法

早期診斷對于骨肉瘤患者預(yù)后改善具有重要意義，組織病理學(xué)檢查是診斷骨肉瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但組織活檢屬有創(chuàng)操作，可增加惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、種植擴(kuò)散及出血等風(fēng)險。因此，外周血miRNAs檢測作為一種高準(zhǔn)確性、高敏感性、微創(chuàng)性的診斷手段受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。外周血miRNAs可能來源于凋亡壞死的腫瘤細(xì)胞、血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的裂解。最新研究顯示外周血miRNAs也可來自組織細(xì)胞的主動分泌途徑，成熟的miRNAs在細(xì)胞內(nèi)被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)，因此組織細(xì)胞中miRNAs與循環(huán)miRNAs必然存在一定的聯(lián)系，研究結(jié)果表明多種miRNAs在組織和體液中具有相同的變化趨勢[13]。此外，外周血中miRNAs在室溫下過夜、反復(fù)凍存、解凍、煮沸、過酸或過堿等惡劣條件下仍可維持穩(wěn)定，進(jìn)一步為循環(huán)miRNAs替代組織活檢而成為新型生化指標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)[13]。

目前檢測miRNA的方法中應(yīng)用最為廣泛的是qRT-PCR技術(shù)，其優(yōu)勢包括：(1)可區(qū)分miRNA前體與成熟體，只定量具有生物學(xué)活性的成熟miRNAs，可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源的不同miRNAs，并能檢測出只有一個堿基序列差別的不同miRNAs表達(dá)水平，靈敏度和特異度均較高；(2)樣品消耗量少，只需要l-l0ng RNA即能檢測出低豐度靶miRNA，定量線性范圍寬；(3)檢測技術(shù)相對更為簡便，費(fèi)用較低，利于在臨床檢測領(lǐng)域大規(guī)模推廣[13,14]。

2.2 外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療中的意義

2.2.1外周血miR-25-3p、miR-17檢測在骨肉瘤中的意義

Fujiwara等[15]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對選取的14位骨肉瘤患者、14位年齡匹配的非骨肉瘤患者及8位健康對照者的血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清中miR-25-3p表達(dá)水平顯著高于非骨肉瘤患者(P=0.004)和健康對照者(P=0.004)，血清miR-25-3p在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中靈敏度為71.4%，特異度為92.3%(AUC=0.868，95% CI=0.743-0.993)，并進(jìn)一步證實(shí)血清miR-25-3p表達(dá)水平與骨肉瘤患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。而血清miR-17-5p表達(dá)水平在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中靈敏度為64.3%，特異度為 84.6%。在體外試驗(yàn)中，骨肉瘤細(xì)胞miR-25-3p、miR-17-5p的表達(dá)水平也顯著升高。Li等[16]選取46名骨肉瘤患者與46名健康對照者外周血樣本進(jìn)行檢測，研究證實(shí)骨肉瘤患者循環(huán)血中miR-17表達(dá)水平顯著升高，并且與磷酸酶、張力蛋白同系物的水平呈負(fù)相關(guān)。此外，研究中骨肉瘤患者循環(huán)血中miR-17表達(dá)水平越高，整體生存期越短，故循環(huán)血miR-17水平可作為判斷骨肉瘤患者預(yù)后狀況的新型指標(biāo)，并有望成為骨肉瘤疾病治療的新靶點(diǎn)。Li等[17]將20名治療前骨肉瘤患者與20名健康對照者納入研究，研究結(jié)果表明miR-25-3p，miR-106a-5p,miR-16-5p,miR-20a-5p,miR-425-5p,miR-451a,miR139-5p在骨肉瘤患者血清中的表達(dá)水平較對照組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2外周血miR-497檢測在骨肉瘤中的意義

Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者外周血、腫瘤組織以及肺轉(zhuǎn)移組織中miR-497表達(dá)水平均顯著降低，其表達(dá)水平與突觸核蛋白γ呈負(fù)相關(guān)。Pang等[19]選取185名骨肉瘤患者與130名健康對照者血清樣本進(jìn)行檢測，研究證實(shí)骨肉瘤患者血清中miR-497水平較對照組顯著降低(P<0.001)，血清中miR-497水平與骨肉瘤疾病臨床分期(P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.001)、化療抵抗(P=0.007)密切相關(guān)。血清miR-497在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中具有較高的參考價值(AUC=0.848，95% CI=0.773-0.923)，并進(jìn)一步證實(shí)血清miR-497表達(dá)水平愈低，患者生存期愈短(P<0.001)。因此，血清中miR-497水平可作為骨肉瘤患者早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷的新型生化指標(biāo)。

2.2.3外周血miR-124、miR-27a檢測在骨肉瘤中的意義

Cong等[20]選取114例骨肉瘤患者、40例骨膜炎患者及50例健康對照者，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測血清中miR-124水平，研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組患者血清中miR-124表達(dá)水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，經(jīng)手術(shù)治療后患者血清中miR-124表達(dá)水平較術(shù)前明顯增高(P<0.01)，血清中miR-124表達(dá)水平與骨肉瘤較高的臨床分期(P=0.0006)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.0256)直接相關(guān)，對骨肉瘤疾病具有良好的鑒別作用(AUC=0.846)，血清miR-124表達(dá)水平愈低，患者臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率愈高，預(yù)計生存期愈短。因此，血清中miR-124水平可作為骨肉瘤患者早期篩查、病情評估、預(yù)后判斷的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。Xu等[21]研究證實(shí)血清中miR-124、miR-27a與骨肉瘤患者的化療敏感性密切相關(guān)。對于化療敏感度差的患者，血清miR-124水平顯著降低，而血清miR-27a水平則明顯升高，上述兩種外泌體可在一定程度上預(yù)測骨肉瘤患者的化療敏感性。Tang等[22]選取166名骨肉瘤患者與60名健康對照者血清樣本進(jìn)行檢測，研究證實(shí)骨肉瘤患者血清中miR-27a水平較對照組顯著升高(P<0.001)，血清中miR-27a高表達(dá)與骨肉瘤較高的臨床分期(P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.01)、化療抵抗(P=0.008)呈正相關(guān)，其對骨肉瘤具有良好的鑒別作用(AUC=0.867)。研究進(jìn)一步證實(shí)血清miR-27a表達(dá)水平愈低，患者術(shù)后無病生存期(P=0.01)、總體生存期(P=0.006)愈短。血清中miR-27a水平有望成為骨肉瘤患者早期篩查、準(zhǔn)確診斷、病情評估、預(yù)后判斷的新型無創(chuàng)性生化指標(biāo)。

2.2.4外周血miR-106a、miR-221檢測在骨肉瘤中的意義

Li等[17]研究表明miR-106a-5p在骨肉瘤患者血清中的表達(dá)水平較對照組顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Nakka等[23]研究表明骨肉瘤組患者血漿中miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)水平顯著高于對照組，血漿中miR-21、miR-221、miR-106a表達(dá)水平可作為骨肉瘤患者早期篩查、準(zhǔn)確診斷、病情評估、預(yù)后判斷的新型標(biāo)記物。Yang等[24]應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測骨肉瘤患者血清與腫瘤組織中miR-221表達(dá)情況，結(jié)果表明骨肉瘤患者血清、腫瘤組織中miR-221水平較對照組顯著降低(P=0.001)，血清中高表達(dá)的miR-221水平與較高的臨床分期(P=0.006)、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.01)呈正相關(guān)。因此，血清miR-221表達(dá)水平可作為骨肉瘤患者生存期的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。

2.2.5其他外周血miRNAs檢測在骨肉瘤中的意義

除上述文獻(xiàn)報道的miRNAs以外，其他多種miRNAs在骨肉瘤患者的外周血中均有異常表達(dá)，并且其水平與骨肉瘤患者的病情嚴(yán)重程度、分級分期、化療敏感性、治療反應(yīng)及疾病預(yù)后均存在密切聯(lián)系。多項(xiàng)研究表明外周血miRNAs水平可作為骨肉瘤診斷、病情進(jìn)展及預(yù)后評估的新型生化指標(biāo)，并有望為骨肉瘤患者的治療提供新的靶點(diǎn)(詳見表1)[15,16,18-21,25-33]。

表1 2016-2017年P(guān)ubmed數(shù)據(jù)庫中文獻(xiàn)報道的外周血miRNAs檢測與骨肉瘤相關(guān)性

3 結(jié)語及展望

近年來，針對外周血miRNAs的研究已成為國際上熱點(diǎn)研究內(nèi)容之一，但目前miRNAs與骨肉瘤的臨床相關(guān)研究尚缺乏大樣本、多中心的數(shù)據(jù)論證。由于miRNA作用的多重性，其在骨肉瘤疾病發(fā)生、發(fā)展中的特異性作用機(jī)制等尚需進(jìn)行深入研究與探討，以期早日應(yīng)用于臨床。隨著研究的不斷開展，外周血miRNAs檢測將在骨肉瘤的早期診斷、鑒別診斷、預(yù)后評估及靶向治療等諸多方面展現(xiàn)出更為廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cai H,Zhao H,Tang J,et al.Serum miR-195 is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma[J].J Surg Res,2015,194(2):505.

[2]Zhou W,Hao M,Du X,et al.Advances in targeted therapy for osteosarcoma[J].Discov Med,2014,17(96):301.

[3]劉書中，勞立峰，王以朋.外周血miRNAs檢測在骨肉瘤中的意義[J].中國生物制品學(xué)雜志,2016,29(5):552.

[4]Zhang J,Yan YG,Wang C,et al.MicroRNAs in osteosarcoma[J].Clin Chim Acta,2015,444:9.

[5]劉書中，李子全，李政垚,等.外周血miR-21檢測在胰腺癌中的意義研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2016,20(6):1038.

[6]Hu H,Zhang Y,Cai XH,et al.Changes in microRNA expression in the MG-63 osteosarcoma cell line compared with osteoblasts[J].Oncol Lett,2012,4(5):1037.

[7]Dai N,Zhong ZY,Cun YP,et al.Alteration of the microRNA expression profile in human osteosarcoma cells transfected with APE1 siRNA[J].Neoplasma,2013,60(4):384.

[8]Lauvrak SU,Munthe E,Kresse SH,et al.Functional characterisation of osteosarcoma cell lines and identification of mRNAs and miRNAsassociated with aggressive cancer phenotypes[J].Br J Cancer,2013,109(8):2228.

[9]Namlos HM,Meza-Zepeda LA,Baroy T,et al.Modulation of the osteosarcoma expression phenotype by microRNAs[J].PLoS One,2012,7(10):e48086.

[10]Gougelet A,Pissaloux D,Besse A,et al.Micro-RNA profiles in osteosarcoma as a predictive tool for ifosfamide response[J].Int J Cancer,2011,129(3):680.

[11]Won KY,Kim YW,Kim HS,et al.MicroRNA-199b-5p is involved in the Notch signaling pathway in osteosarcoma[J].Hum Pathol,2013,44(8):1648.

[12]Ouyang L,Liu P,Yang S,et al.A three-plasma miRNA signature serves as novel biomarkers for osteosarcoma[J].Med Oncol,2013,30(1):340.

[13]Cappelletti V,Appierto V,Tiberio P,et al.Circulating Biomarkers for Prediction of Treatment Response[J].J Natl Cancer Inst Monogr,2015,2015(51):60.

[14]Urbanek MO,Nawrocka AU,Krzyzosiak WJ,et al.Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods[J].Int J Mol Sci,2015,16(6):13259.

[15]Fujiwara T,Uotani K,Yoshida A,et al.Clinical significance of circulating miR-25-3p as a novel diagnostic and prognostic biomarker in osteosarcoma[J].Oncotarget,2017,8(20):33375.

[16]Li S,Gao Y,Wang Y,et al.Serum microRNA-17 functions as a prognostic biomarker in osteosarcoma[J].Oncol Lett,2016,12(6):4905.

[17]Li H,Zhang K,Liu LH,et al.MicroRNA screening identifies circulating microRNAs as potential biomarkers for osteosarcoma[J].Oncol Lett,2015,10(3):1662.

[18]Wang L,Gao H,Gong N,et al.Downregulation of microRNA-497 is associated with upregulation of synuclein γ in patients with osteosarcoma[J].Exp Ther Med,2016,12(6):3761.

[19]Pang PC,Shi XY,Huang WL,et al.miR-497 as a potential serum biomarker for the diagnosis and prognosis of osteosarcoma[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(18):3765.

[20]Cong C,Wang W,Tian J,et al.Identification of serum miR-124 as a biomarker for diagnosis and prognosis in osteosarcoma[J].Cancer Biomark,2017,[Epub ahead of print]

[21]Xu JF,Wang YP,Zhang SJ,et al.Exosomes containing differential expression of microRNA and mRNA in osteosarcoma that can predict response to chemotherapy[J].Oncotarget,2017,8(44):75968.

[22]Tang J,Zhao H,Cai H,et al.Diagnostic and prognostic potentials of microRNA-27a in osteosarcoma[J].Biomed Pharmacother,2015,71:222.

[23]Nakka M,Allen-Rhoades W,Li Y,et al.Biomarker significance of plasma and tumor miR-21,miR-221,and miR-106a in osteosarcoma[J].Oncotarget,2017,8(57):96738.

[24]Yang Z,Zhang Y,Zhang X,et al.Serum microRNA-221 functions as a potential diagnostic and prognostic marker for patients with osteosarcoma[J].Biomed Pharmacother,2015,75:103.

[25]Zhou S,Wang B,Hu J,et al.miR-421 is a diagnostic and prognostic marker in patients with osteosarcoma[J].Tumour Biol,2016,37(7):9001.

[26]Dong J,Liu Y,Liao W,et al.miRNA-223 is a potential diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma[J].J Bone Oncol,2016,5(2):74.

[27]Sun Y,He N,Dong Y,et al.MiR-24-BIM-Smac/DIABLO axis controls the sensitivity to doxorubicin treatment in osteosarcoma[J].Sci Rep,2016,6:34238.

[28]Cao L,Wang J,Wang PQ.MiR-326 is a diagnostic biomarker and regulates cell survival and apoptosis by targeting Bcl-2 in osteosarcoma[J].Biomed Pharmacother，2016,84:828.

[29]Niu J,Sun Y,Guo Q,et al.Serum miR-95-3p is a diagnostic and prognostic marker for osteosarcoma[J].Springerplus,2016,5(1):1947.

[30]Liu K,Sun X,Zhang Y,et al.MiR-598:A tumor suppressor with biomarker significance in osteosarcoma[J].Life Sci,2017,188:141.

[31]Wang SN,Luo S,Liu C,et al.miR-491 Inhibits Osteosarcoma Lung Metastasis and Chemoresistance by Targeting αB-crystallin[J].Mol Ther,2017,25(9):2140.

[32]Liu K,Sun X,Zhang Y,et al.MiR-598:A tumor suppressor with biomarker significance in osteosarcoma[J].Life Sci,2017,188:141.

[33]Li Q,Song S,Ni G,et al.Serum miR-542-3p as a prognostic biomarker in osteosarcoma[J].Cancer Biomark,2017,[Epub ahead of print]