山莨菪堿聯(lián)合普羅布考對糖尿病大鼠造影劑腎損傷凋亡基因FAS/FASL表達(dá)的影響

戈立秀，趙 凱，高巧營，高 晟，李景照，李永健，常艷敏

(1.天津市南開醫(yī)院 檢驗科，天津300100；2.天津市南開醫(yī)院 心血管內(nèi)科；3.天津市南開醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所)

隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入技術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)在臨床中的廣泛應(yīng)用，因造影劑導(dǎo)致的造影劑腎病(contrast-induced nephropathy,CIN) 日益增加。CIN已成為了院內(nèi)獲得性急性腎損傷的重要原因之一[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)接受冠脈造影介入治療的患者中CIN發(fā)病率為8.7%[3]。當(dāng)患者伴有慢性腎病、糖尿病或高血壓等基礎(chǔ)疾病時，使用高滲造影劑可使CIN發(fā)生率高達(dá)25%[4]。目前大多學(xué)者認(rèn)為腎血管收縮誘導(dǎo)的腎小管缺氧性損傷以及造影劑直接對腎小管細(xì)胞的殺傷作用是導(dǎo)致CIN的主要機(jī)制[5]。造影劑可誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡參與腎臟多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)過程。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的諸多因素中FAS及其配體FASL是最具有代表性[6]。

近年來醫(yī)務(wù)工作者一直在尋找有效、簡便的CIN預(yù)防措施[7]。研究者發(fā)現(xiàn)普羅布考和山莨菪堿在治療腎臟疾病中具有保護(hù)腎組織的作用[8,9]。但目前關(guān)于山莨菪堿聯(lián)合普羅布考對CIN治療的相關(guān)研究尚不多見。本研究通過建立CIN大鼠模型，檢測藥物干預(yù)前后大鼠腎臟細(xì)胞凋亡基因FAS、FASL及其蛋白的表達(dá)水平，探討上述藥物對CIN的預(yù)防機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物與試劑45只健康雄性SD大鼠，體重240-260 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境所動物中心提供，清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)(許可證號SCXK(軍)2009-003)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)；復(fù)方泛影葡胺注射液(購于湖南漢森制藥股份有限公司)；FAS和FASL單克隆抗體(美國CST公司提供)；NGAL和IL-18檢測試劑盒(上海藍(lán)基生物有限公司)；KIM-1檢測試劑盒(美國R&D公司)；動物組織RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2糖尿病大鼠模型建立及分組SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，造模前檢測大鼠尾靜脈血糖，均顯示在正常范圍。所有大鼠以腹腔單劑量注射鏈脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及7天后檢測大鼠血糖，以非禁食血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型成功與否。將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為對照組(N組)、造影劑腎病組(M組)、山莨菪堿組(A組)、普羅布考組(P組)、山莨菪堿聯(lián)合普羅布考組(A+P組)，每組9只。

1.3CIN模型建立及取材根據(jù)焦占全[10]和賈辛未[11]CIN 造模及用藥方法，結(jié)合山莨菪堿及普羅布考藥代動力學(xué)特點(diǎn)，大鼠飼養(yǎng)9w后，P組及A+P組大鼠給予普羅布考(500 mg/kg)灌胃，N組和M組以等量生理鹽水灌飼，連續(xù)6 d，第7天禁水不禁食。7 d后，麻醉狀態(tài)下，注射泛影葡胺前15 min，A組、A+P組分別給予山莨菪堿100 μg/100 g腹腔注射，N組、M組、P組則給予等量生理鹽水腹腔注射。A組、A+P組于注射造影劑后4 h內(nèi)每小時腹腔注射山莨菪堿(100 μg/100 g)1次，至第4-12 h每4 h重復(fù)腹腔注射山莨菪堿，N組、M組、P組則于相應(yīng)時間腹腔注射等量生理鹽水。以血清Scr值高于基礎(chǔ)值的25%判定CIN的模型是否成功。

于注射造影劑前、注射后24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，開腹采集下腔靜脈血2 ml，迅速取下雙腎稱重，留取腎組織。

1.4腎功能及損傷指標(biāo)檢測脲酶法測定血清尿素氮(BUN)；苦味酸法測定血清肌酐(Scr)；ELISA法檢測尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷因子-1(KIM-1)、白介素18(IL-18)。

1.5FAS和FASL基因mRNA檢測參照試劑盒說明提取各組大鼠腎組織總RNA及逆轉(zhuǎn)錄。FAS、FASL和β-actin引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見表1。應(yīng)用IQ5型熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測，結(jié)果參照2-△△Ct法[12]進(jìn)行分析。

表1 各基因引物序列

1.6FAS和FASL蛋白檢測參照提取試劑盒說明提取大鼠腎組織總蛋白，熱變性處理后經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉封閉3 h。FAS和FASL單克隆抗體4℃孵育過夜，二抗孵育2 h后化學(xué)發(fā)光法發(fā)光成像。以β-actin為內(nèi)參照。

1.7腎臟組織病理檢測腎臟組織經(jīng)10%甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，于正置顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠造影24h后腎臟功能指標(biāo)變化情況與N組比較，M 組大鼠BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明顯升高。與M組比較，A組Scr、腎指數(shù)含量明顯降低，而BUN、NAGL、KIM-1、IL-18均無明顯變化；P組BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、IL-18含量均明顯降低，而KIM-1無明顯變化；A+P組BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明顯降低。與A組比較，A+P組BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明顯降低。與P組比較，A+P組BUN、Scr、KIM-1含量均明顯降低，腎指數(shù)、NAGL、IL-18均無明顯變化。見表2。

表2 給予藥物干預(yù)后大鼠腎臟功能各指標(biāo)的變化情況

注：與N組比較，a)P<0.05；與M組比較，b)P<0.05；與A組比較，c)P<0.05；與P組比較，d)P<0.05

2.2腎臟FAS、FASL基因表達(dá)水平與N比較，M組的FAS和FASL基因水平均明顯升高；與M比較，A組和P組只有FASL基因水平降低，而A+P組FAS、FASL基因水平均有很大程度的下降；與A組比較，A+P組大鼠FAS、FASL基因表達(dá)水平均明顯降低；與P組比較，A+P組大鼠FAS表達(dá)水平有所降低，F(xiàn)ASL表達(dá)水平無變化。見表3。

2.3腎臟FAS、FASL蛋白表達(dá)水平Western Blotting結(jié)果顯示(見圖1)，M組大鼠腎臟組織中FAS和FASL蛋白表達(dá)量明顯高于N組；A組、P組只有FASL表達(dá)量低于M組，而A+P組大鼠腎臟的FAS和FASL蛋白表達(dá)水平均低于M組。

表3 給予藥物干預(yù)后各組大鼠FAS、FASL基因表達(dá)變化

注：與N組比較，a)P<0.05；與M組比較，b)P<0.05；與A組比較，c)P<0.05；與P組比較，d)P<0.05

1.N組；2.M組；3.A組；4.P組；5.A+P組

2.4腎臟病理改變各組大鼠腎組織的HE染色結(jié)果(見圖2)， N組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)未見病變。M組大鼠腎小體有的呈分葉狀，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡樣變性、局部壞死；A組和P組大鼠腎臟的病理變化基本同M組，A+P組病變稍有好轉(zhuǎn)。

圖2 各組大鼠腎臟病理變化(HE染色，×200)

3 討論

近年來隨著心臟介入診療技術(shù)的發(fā)展，造影劑被廣泛應(yīng)用于臨床，由其誘導(dǎo)的CIN也逐漸被人們認(rèn)識。但CIN 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)[1,13]，造影劑能直接損傷糖尿病大鼠腎小管，誘導(dǎo)小管上皮細(xì)胞凋亡；可促進(jìn)氧自由基、炎癥因子等產(chǎn)生，參與細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致糖尿病大鼠發(fā)生腎損傷，導(dǎo)致腎臟形態(tài)及功能異常。本研究采用糖尿病大鼠經(jīng)尾靜脈注射復(fù)方泛影葡胺造影劑構(gòu)建CIN模型,發(fā)現(xiàn)造影劑腎病組大鼠體重增加緩慢或減輕；大鼠腎臟明顯增大，腎指數(shù)明顯高于對照組(表2)；大鼠BUN、Scr水平明顯高于對照組；且大鼠腎小體呈分葉狀，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡樣變性、局部壞死(腎臟病理HE染色)。目前常規(guī)的Scr、BUN等指標(biāo)的變化滯后于腎損傷的發(fā)生，并不能及時反映腎功能狀態(tài)。一些早期生物學(xué)標(biāo)記物，如NGAL、IL-18、KIM-1等用于反映腎臟損傷的早期診斷[14,15]。本研究檢測了上述三個指標(biāo)，結(jié)果顯示造影劑腎病組大鼠尿NGAL、KIM-1及IL-18的水平均高于對照組。由上可見造影劑腎病組大鼠已出現(xiàn)腎臟損傷表現(xiàn)。

山莨菪堿已被廣泛用于治療糖尿病腎病，對腎功能具有良好保護(hù)作用。普羅布考的抗氧化性能可以抑制氧化的低密度脂蛋白膽固醇的形成，對于因動脈粥樣硬化導(dǎo)致的急性冠脈綜合征有較好的治療效果。急性冠狀動脈綜合征術(shù)后可影響腎功能改變[16]。趙凱等[8]發(fā)現(xiàn)，對接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的不穩(wěn)定型心絞痛老年患者預(yù)防性應(yīng)用普羅布考可有效減少CIN的發(fā)生。本研究中造影劑腎病組大鼠給予山莨菪堿、普羅布考及聯(lián)合藥物干預(yù)后，與造影劑腎病組相比，山莨菪堿組除Scr、腎指數(shù)明顯降低外，其他如BUN、NAGL、KIM-1、IL-18均無明顯變化，普羅布考組BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、IL-18含量均明顯降低，只有KIM-1無明顯變化，聯(lián)合組BUN、Scr、腎指數(shù)、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明顯降低，由此推測普羅布考在改變CIN大鼠腎功能方面優(yōu)于山莨菪堿，而兩藥聯(lián)合使用效果更佳。

目前CIN的發(fā)病機(jī)制尚不明確。造影劑可直接損傷腎小管和促進(jìn)氧自由基、炎癥因子等產(chǎn)生，誘導(dǎo)腎組織細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡受多種因素調(diào)控，其中受體介導(dǎo)凋亡途徑中最具代表性的為FAS/FASL系統(tǒng)，它是誘發(fā)腎臟多種細(xì)胞凋亡的重要蛋白。FAS屬于TNF細(xì)胞因子超家族，當(dāng)腎組織上的FASL與靶細(xì)胞的FAS結(jié)合后，對腎小球和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[17]。山莨菪堿是我國首先從茄科植物唐古特山莨菪中提取的一種生物堿，屬 M-膽堿能受體阻斷劑。研究證實(shí)，山莨菪堿具有解除微血管痙攣和改善微循環(huán)的作用，進(jìn)而改變腎功能[18]。普羅布考是目前已知最強(qiáng)的斷鏈抗氧化劑，其分子內(nèi)所含的酚羥基很容易被氧化而發(fā)生斷鏈，捕捉氧離子并與之結(jié)合后形成穩(wěn)定的酚氧基，有效降低血漿氧自由基水平，具有明顯的抗氧化、抗細(xì)胞凋亡的作用[19]。本研究中，造影劑腎病組大鼠腎臟FAS和FASL的表達(dá)升高，由此可見造影劑腎病組大鼠腎臟凋亡細(xì)胞增加。給予山莨菪堿和普羅布考后，大鼠FASL基因有不同程度的降低，說明山莨菪堿和普羅布考單獨(dú)用藥可抑制調(diào)亡基因FASL；給予聯(lián)合藥物干預(yù)后的大鼠FAS和FASL基因表達(dá)低于山莨菪組和普羅布考組，可見聯(lián)合用藥下調(diào)大鼠凋亡基因FAS和FASL的作用更強(qiáng)。故而推測CIN模型大鼠給山莨菪堿、普羅布考及聯(lián)合藥物干預(yù)后，在一定程度上均可下調(diào)FAS/FASL表達(dá)，減少腎臟細(xì)胞的凋亡，且普羅布考和山莨菪堿聯(lián)合具有協(xié)同作用。

綜上，山莨菪堿、普羅布考及兩者聯(lián)合使用均可下調(diào)FAS/FASL的表達(dá)，減少腎細(xì)胞凋亡，減輕腎損傷。兩藥聯(lián)合在抑制腎細(xì)胞凋亡方面具有協(xié)同作用。

作者簡介：戈立秀(1983-)，女，碩士，主管技師，臨床醫(yī)師。主要從事心血管疾病的實(shí)驗室檢測研究。

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