維生素D受體基因啟動(dòng)子甲基化異常與嬰兒尿路感染相關(guān)性研究

楊建環(huán) 王德選 陳敏廣 胡小涵

尿路感染是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的發(fā)熱性疾病之一，約2%的男孩和8%的女孩在6歲內(nèi)曾患過(guò)急性尿路感染，反復(fù)的尿路感染可引起腎瘢痕形成、高血壓、腎功能不全等[1]。維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）是核受體超家族成員之一，在哺乳動(dòng)物中幾乎所有組織均表達(dá)VDR[2]。維生素D3/VDR信號(hào)涉及機(jī)體的礦物質(zhì)代謝和骨穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，并在癌癥預(yù)防及調(diào)節(jié)免疫功能等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一，而DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）參與了DNA甲基化過(guò)程[5]。基因啟動(dòng)子區(qū)域和增強(qiáng)子區(qū)域CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法與DNA相結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄；而特定基因的低甲基化可導(dǎo)致該基因呈過(guò)度表達(dá)狀態(tài)，從而參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[6]。研究表明VDR基因啟動(dòng)子甲基化異?？赡芘c某些疾病的發(fā)生相關(guān)，如乳腺癌患者的VDR基因啟動(dòng)子甲基化異?？赡芘c化療耐藥相關(guān)[7]。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)VDR基因啟動(dòng)子甲基化異常與嬰兒尿路感染的相關(guān)性研究尚少，因此本研究旨在探討尿路感染嬰兒VDR基因表達(dá)變化，同時(shí)研究DNA甲基化異常對(duì)VDR基因表達(dá)的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2015年8月至2016年2月在本院兒童腎內(nèi)科住院的急性尿路感染患兒32例（尿路感染組），年齡1～12個(gè)月。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）初發(fā)的發(fā)熱性尿路感染；（2）主要臨床癥狀為發(fā)熱、喂養(yǎng)困難、嘔吐、尿液渾濁、尿臭、排尿哭吵不安、精神萎靡等；（3）白細(xì)胞尿或膿尿；（4）腎靜態(tài)核素顯像提示腎盂腎炎。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并腎臟或泌尿道先天性畸形的嬰兒；（2）合并尿路結(jié)石。選擇同期本院門(mén)診健康體檢嬰兒30例作為健康對(duì)照組，年齡1～12個(gè)月。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患兒家屬知情同意。

1.2 VDR、DNMTs mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。先用Trizol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA（PrimeScript RT reagent Kit，大連寶生物工程有限公司）。再用SYBR Green熒光定量PCR法檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平[FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），羅氏（Roche）生物公司]，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性 10s，60℃退火 20s、72℃延伸 20s，共 40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果以 2-ΔCT相對(duì)定量表示，所有樣本均設(shè)置復(fù)孔。引物合成由上海生工生物有限公司完成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.3 重亞硫酸氫鈉測(cè)序技術(shù)（BSP）檢測(cè)VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平 提取樣本的全血基因組DNA 1ng～2μg，血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)置天根生化科技（北京）有限公司，操作過(guò)程參考說(shuō)明書(shū)。經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后[EpiTect bisulfite kit試劑盒，凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司，操作過(guò)程參考說(shuō)明書(shū)]，DNA序列中非甲基化的脫氧胞嘧啶（C）均被亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跄蜞奏ぃ║），而甲基化狀態(tài)下脫氧胞嘧啶（C）不會(huì)被亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)變。將亞硫酸氫鈉處理后的基因組DNA送檢上海生工生物有限公司進(jìn)行BSP分析。尿路感染組和健康對(duì)照組各送檢12例樣本，每例樣本檢測(cè)5個(gè)克隆。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VDR mRNA表達(dá)水平比較 尿路感染組患兒VDR mRNA表達(dá)水平為0.096±0.015，高于健康對(duì)照組嬰兒的0.046±0.009，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 1。

圖1 兩組VDR mRNA表達(dá)水平比較

2.2 兩組DNMTs mRNA表達(dá)水平比較 尿路感染組患兒DNMT1 mRNA表達(dá)水平為0.034±0.006，低于健康對(duì)照組嬰兒的0.057±0.009，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。尿路感染組患兒 DNMT3a mRNA表達(dá)水平為0.056±0.009，健康對(duì)照組嬰兒為0.072±0.010，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。尿路感染組患兒DNMT3b mRNA表達(dá)水平為0.038±0.005，低于健康對(duì)照組嬰兒的 0.045±0.007，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

2.3 兩組VDR基因甲基化水平比較 BSP檢測(cè)結(jié)果顯示，VDR基因片段中共含有13個(gè)CpG位點(diǎn)。12例尿路感染組患兒VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平為（0.00±0.00）%，而健康對(duì)照組嬰兒VDR基因啟動(dòng)子的甲基化水平為（5.31±8.19）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示尿路感染患兒的VDR基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài)，見(jiàn)圖5。

圖2 兩組DNMT1 mRNA表達(dá)水平比較

圖3 兩組DNMT3a mRNA表達(dá)水平比較

圖4 兩組DNMT3b mRNA表達(dá)水平比較

圖5 兩組VDR基因甲基化水平比較

3 討論

VDR是介導(dǎo)維生素D發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)生物大分子，屬于甲狀腺激素受體和類(lèi)固醇激素受體的超家族成員。既往研究發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏與嬰兒尿路感染相關(guān)[8]，本研究探討了VDR與嬰兒尿路感染的關(guān)系，結(jié)果提示尿路感染患兒VDR mRNA表達(dá)水平升高。這可能與機(jī)體通過(guò)提高VDR的表達(dá)水平，來(lái)增強(qiáng)維生素D與VDR的結(jié)合，從而彌補(bǔ)尿路感染患兒維生素D不足所帶來(lái)的效應(yīng)。

為進(jìn)一步探討尿路感染患兒VDR mRNA表達(dá)增高的機(jī)制，筆者進(jìn)一步研究了DNA甲基化對(duì)VDR基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用。筆者采用BSP檢測(cè)VDR啟動(dòng)子的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)12例尿路感染組患兒VDR基因啟動(dòng)子為完全低甲基化，甲基化水平為（0.00±0.00）%；而健康對(duì)照組嬰兒VDR基因啟動(dòng)子甲基化水平為（5.31±8.19）%。因此尿路感染患兒VDR基因啟動(dòng)子呈低甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致VDR mRNA表達(dá)水平增高，從而影響維生素D與VDR的結(jié)合。由此推測(cè)尿路感染患兒的VDR基因表達(dá)受DNA甲基化水平的影響，DNA低甲基化水平促進(jìn)VDR基因的表達(dá)。

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG二核苷酸的5′側(cè)胞嘧啶上，而絕大多數(shù)CpG位點(diǎn)在細(xì)胞的整個(gè)生命周期中保持著甲基化狀態(tài)[9]。CpG島的位置主要處于基因啟動(dòng)子區(qū)域，且CpG島的甲基化可直接導(dǎo)致相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉默[10]。既往研究表明VDR基因甲基化異常可能與某些疾病的發(fā)生相關(guān)，例如乳腺癌患者的VDR基因甲基化異?？赡芘c化療耐藥相關(guān)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)VDR基因甲基化異常與嬰兒尿路感染相關(guān)。

DNMTs是催化DNA甲基化的主要反應(yīng)酶，包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同維持基因組DNA的甲基化穩(wěn)定[11]。在正常成人組織中，DNMT1呈持續(xù)性低表達(dá)狀態(tài)，DNMT3a與DNMT3b呈失表達(dá)或低表達(dá)狀態(tài)；而在癌細(xì)胞中DNMTs呈過(guò)度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，DNMT1、DNMT3b的表達(dá)水平比正常組織升高2～4倍[12]。本研究對(duì)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)尿路感染患兒的DNMT1 mRNA表達(dá)水平降低，而DNMT3a、DNMT3b mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，提示DNMT1表達(dá)水平降低可能與尿路感染患兒VDR基因啟動(dòng)子的低甲基化水平相關(guān)。

綜上所述，筆者推測(cè)尿路感染患兒DNMT1表達(dá)水平降低導(dǎo)致VDR基因啟動(dòng)子的低甲基化水平，從而引起VDR mRNA表達(dá)水平升高。本研究從表觀遺傳學(xué)水平上探討了VDR基因表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制，為今后深入研究表觀遺傳學(xué)與VDR基因表達(dá)的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。由于本研究是基于臨床的病例對(duì)照分析，可能存在樣本偏差，今后需要更大的臨床樣本數(shù)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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