背入式腹膜后雙腎蒂夾閉制作腎缺血再灌注損傷模型的技術(shù)方法

謝敏慧，谷翠芝，李鳳霞，李清初*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 桂林　541001； 2.桂林醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，廣西 桂林　541004)

腎缺血再灌注損傷 (ischemia-reperfusion injury，IRI) 是因腎臟供血中斷或者不足引發(fā)急性腎損傷，當(dāng)重新恢復(fù)灌流后腎損傷繼續(xù)加重，甚至導(dǎo)致腎衰竭，是急性腎損傷的主要發(fā)病機制之一[1]。建立穩(wěn)定的腎缺血再灌注損傷模型是研究急性腎損傷發(fā)病機制和預(yù)防治療的重要保障[2]。

目前腎缺血再灌注損傷的動物模型大多經(jīng)腹部切口[3-4]，術(shù)中需要打開腹腔，牽拉胃腸道，易引起動物胃腸功能紊亂；使用的動物多為小鼠和大鼠，鼠為爬行體位的動物，腹部靠地，切口容易受刺激和污染，可能加劇動物機體的應(yīng)激狀態(tài)和炎癥改變，干擾研究結(jié)果。從背部切口已有報道[5]，系經(jīng)背部正中偏右近第12肋切口，通過游離腹主動脈后分離并夾閉左、右腎動脈，血管易受到牽拉而引起出血；且腎動脈夾閉期間切口未關(guān)閉，腹膜后間隙與外界相通有增加脫水或感染的風(fēng)險。對此筆者改進手術(shù)方式，從大鼠背部正中皮膚切口，通過皮膚牽拉，再從兩側(cè)筋膜和肌肉切口，進入腹膜后間隙，分離雙側(cè)腎蒂，用無損傷微型動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂成功建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，此方法皮膚切口與筋膜肌肉切口錯開，腎動脈夾閉期間筋膜肌肉切口被皮膚覆蓋，且不用牽拉腹主動脈。具體報告如下。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

SPF級雄性SD大鼠36只，8～10周齡，體重(240±20)g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物飼養(yǎng)中心提供[SCXK(桂)2013-0001]，實驗室溫度24℃～26℃，濕度60%～70%，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷(倫理委員會批準(zhǔn)編號：GLMC20180395)。大鼠在該中心實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，隨機分為正常組(C組，n=8)、假手術(shù)組(S組，n=8)和實驗組(IR組，n=20)。

1.2　主要試劑與儀器

10%水合氯醛(成都科龍化學(xué)試劑廠，批號2015090601)；尿素氮測試盒(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，批號196836-01)；肌酐測試盒(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，批號20313801)；4%多聚甲醛(西隴化工股份有限公司，批號1502262)；HE試劑由桂林醫(yī)學(xué)院病理實驗室配制。

自動生化分析儀(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，型號COBASC 501)。顯微鏡及成像系統(tǒng)(Olympus，型號 BX53)；小組織剪、眼科鑷、無創(chuàng)微型動脈夾、小彎鉗、線剪、執(zhí)針器，標(biāo)尺。

1.3　實驗方法

1.3.1動物模型建立

大鼠術(shù)前8～12 h禁食，用10%水合氯醛(0.3 g/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，大鼠麻醉后俯臥位固定于手術(shù)板上，背部備皮消毒后于雙側(cè)肋弓角水平線與背部正中交接處向下縱行切開皮膚約2 cm，向右牽拉皮膚，于右12肋下偏右約1 cm處沿12肋方向斜向外側(cè)剪開腰背部筋膜與肌肉約1 cm，用小彎鉗鉗夾牽引固定，暴露腹膜后間隙和右腎，鈍性分離右腎蒂，用無損傷動脈夾夾閉右腎蒂，松開小彎鉗；將皮膚向左牽拉，使切口暴露于左12肋下，于肋下偏左約1 cm處向下縱向剪開左側(cè)腰背部筋膜與肌肉約1 cm，用小彎鉗鉗夾牽引固定，暴露腹膜后間隙和左腎，鈍性分離左腎蒂，用無損傷動脈夾夾閉左腎蒂，松開小彎鉗，皮膚恢復(fù)正常位置，遮蓋了兩側(cè)內(nèi)部切口。皮膚切口用無菌紗布覆蓋，白熾燈照射保溫。50 min后松開動脈夾，觀察雙腎灌注良好后，逐層縫合切口。術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水與進食。假手術(shù)組：不夾閉雙側(cè)腎蒂，其余步驟與實驗組相同。正常組僅做麻醉處理。

模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)中夾閉雙側(cè)腎蒂后，見雙腎由鮮紅色變?yōu)樽虾谏?；松開動脈夾后，血流恢復(fù)灌注，5 min內(nèi)見雙腎由紫黑色變?yōu)轷r紅色；且術(shù)后3 h內(nèi)大鼠蘇醒。

1.3.2觀察術(shù)中情況與大鼠生存狀況

記錄手術(shù)時間、麻醉清醒時間，測量皮膚、肌肉切口長度等，觀察大鼠精神狀態(tài)、進食、飲水以及活動情況等，計算造模成功率。

1.3.3腎功能檢測

于腎缺血再灌注24 h后經(jīng)心臟穿刺取血，靜置2 h，4℃ 4000 r/min離心5 min，取血清經(jīng)全自動生化分析儀檢測血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)。

1.3.4腎組織病理學(xué)檢查

大鼠腎缺血再灌注24 h后進行頸椎脫臼法處死，取雙側(cè)腎臟，從腎臟中間橫切取1/2腎組織置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，進行HE染色，×400光鏡下觀察腎組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)，腎小管病變包括腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死、刷狀緣脫落、管型形成及炎性細(xì)胞浸潤等。根據(jù)腎小管病變程度，用Hauet等[6]半定量病理評估法評分(最高分是5分)。1分：正常腎臟；2分：<25%的腎小管病變；3分：25%～50%的腎小管病變；4分：50%～75%的腎小管病變；5分：>75%的腎小管病變。每個樣本隨機選取10個不互相重復(fù)的視野，分別計算每個視野的腎小管損傷分?jǐn)?shù)，取10個視野評分的平均值作為每個樣本的評分值。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　術(shù)中情況與大鼠生存狀況

2.1.1術(shù)中情況

假手術(shù)組皮膚切口(2.24±0.14)cm，右腰背部筋膜與肌肉切口(1.27±0.13)cm，左側(cè)腰背部筋膜與肌肉切口(1.28±0.14)cm。實驗組皮膚切口(2.24±0.27)cm，右腰背部筋膜與肌肉切口(1.36±0.21)cm，左側(cè)腰背部筋膜與肌肉切口(1.36±0.24)cm。從切開皮膚至夾閉雙腎蒂用時(3.30±0.37)min。術(shù)中出血少，無需止血或擦拭滲血，視野清楚。

2.1.2大鼠生存狀況

除實驗組1只大鼠于腎蒂結(jié)扎后 5 min死亡外，其余 35 只大鼠術(shù)后 24 h均成活。正常組大鼠麻醉后(58.25±2.77)min蘇醒，精神好，活動自如，飲食正常。假手術(shù)組大鼠麻醉后(70.75±2.12)min蘇醒，12 h內(nèi)精神欠佳，活動減少，飲食較少，12 h后精神尚可，飲食、活動恢復(fù)正常。實驗組：大鼠在麻醉后(97.26±6.86)min蘇醒，12 h內(nèi)精神萎靡，活動緩慢，很少進食，12 h后精神欠佳，進食與活動減少。實驗組20只大鼠，造模成功19 例，成功率為 95%。死亡大鼠解剖未發(fā)現(xiàn)明顯異常，可能為麻醉意外死亡。

2.2　大鼠血Cr、BUN水平

與正常組或假手術(shù)組比較，實驗組大鼠血清血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平明顯增高(P< 0.01)，假手術(shù)組與正常組間這兩項指標(biāo)差異無顯著性(P> 0.05)，提示實驗組大鼠腎功能受損。(見表1)

2.3　大鼠腎組織病理學(xué)變化

2.3.1大體變化

大鼠腎臟的大體形態(tài)在正常組、假手術(shù)組與實驗組雙腎蒂夾閉前無明顯差別，可見雙腎顏色鮮紅，表面光滑，無腫脹。實驗組雙腎蒂夾閉后可見雙腎顏色變?yōu)樽虾谏?，被膜緊張，呈淤血狀。松開動脈夾后，可見雙腎顏色逐漸轉(zhuǎn)鮮紅。(見圖1)

表 1　各組大鼠血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平

注：與正常組比較，*P< 0.05；與假手術(shù)組比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the normal group，*P< 0.05. Compared with the sham-operated group，#P< 0.05.

注：(a)腎蒂夾閉前；(b)腎蒂夾閉后；(c)松開動脈夾后。圖1　大鼠腎臟缺血前、缺血后、再灌注后顏色變化Note.(a)Before clamping the renal pedicle.(b)After clamping the renal pedicle.(c)After loosening the artery clamp.Fig.1　Changes of the color of kidneys (arrows) before and after ischemia, and after reperfusion in the rats

2.3.2光鏡下變化

正常組與假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞完整，排列整齊。實驗組可見近曲小管結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂或塌陷，腔內(nèi)可見管型；大量腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分上皮細(xì)胞有核固縮、胞漿深染，脫落壞死，部分腎小管管腔擴張、管腔輪廓模糊；間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤。(見圖2)

2.3.3腎小管損傷分?jǐn)?shù)

腎小管損傷分?jǐn)?shù)由病理科專業(yè)醫(yī)師進行盲評。統(tǒng)計分析顯示，實驗組損傷分?jǐn)?shù)明顯高于假手術(shù)組與正常組(P< 0.01)，假手術(shù)組與正常組間差異無顯著性(P> 0.05)。(見圖3)

3　討論

急性腎損傷是臨床常見的急危重癥，雖然治療措施有了明顯改善，但其發(fā)病率與死亡率仍然很高[1]。腎臟缺血再灌注損傷被認(rèn)為是急性腎損傷與慢性腎衰竭的主要發(fā)病基礎(chǔ)，腎IRI動物模型是研究這些疾病發(fā)病機制和預(yù)防治療的重要手段。文獻報道的腎IRI動物模型制作方法包括夾閉雙側(cè)腎蒂(或雙側(cè)腎動脈、腎靜脈)或夾閉單側(cè)腎動脈+切除對側(cè)腎[2]，模擬雙側(cè)或單側(cè)腎缺血再灌注，復(fù)制的模型出現(xiàn)以腎小管損傷為主的腎功能和結(jié)構(gòu)損傷，類似于臨床多數(shù)急性腎損傷。最常使用的動物為大鼠與小鼠，手術(shù)方式普遍采用經(jīng)腹部切口[3-4,7-10]。有研究者認(rèn)為腹部切口易牽拉和暴露胃腸道,對大鼠的生理狀態(tài)影響較大[11]。鼠類活動以爬行為主，活動時將不斷刺激腹部切口，也容易使切口污染，增加感染幾率，可能影響動物的應(yīng)激狀態(tài)和炎癥水平，干擾實驗結(jié)果。本研究從背部正中切口，因大鼠皮膚比較松馳，通過切口皮膚的牽拉，于左右肋下切開雙側(cè)腰背部筋膜與肌肉，從腹膜后夾閉雙側(cè)腎蒂，成功建立腎缺血再灌注模型。此方法無需打開腹腔，不接觸胃腸道，不影響胃腸功能；皮膚切口與肋下切口位置錯開，腎蒂夾閉期間肋下切口被皮膚覆蓋，內(nèi)臟不會暴露，失水和感染幾率下降；大鼠背部臟器較少，切開筋膜出血少，視野清楚，腹膜后腎臟暴露充分，不易傷及周圍器官；切口在背部，大鼠活動幾乎不受影響，切口不易受污染。

本研究中，模型成功率95%，且隨著再灌注時間延長，大鼠活動、飲食恢復(fù)良好；再灌注24 h腎功能損傷顯著，血肌酐和尿素氮比正常值增加6～10倍；光鏡下腎組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，腎小管出現(xiàn)斷裂或塌陷，腔內(nèi)可見管型；大量小管上皮細(xì)胞水腫、壞死和脫落，部分間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤。這些實驗結(jié)果表明，動物模型的腎臟功能和組織結(jié)構(gòu)受損明顯，提示這種背入式腹膜后夾閉雙腎蒂的模型制作方法符合腎缺血再灌注損傷的研究要求。

鑒于文獻一般分析的是藥物或信號通路等處理因素對實驗動物的影響，對模型制作成功率報道較少見，尚不能確定何種方式成功率更高。以往的研究焦點多在動物的種屬、體重、年齡、性別及缺血時間、手術(shù)方式等因素對腎缺血再灌注模型動物的腎功能、形態(tài)、結(jié)構(gòu)與預(yù)后的影響，而研究模型制作方法對動物生理狀態(tài)的影響較少，作者將繼續(xù)研究背入式與腹部切口方式對動物生理狀態(tài)的影響，如應(yīng)激相關(guān)因子和炎癥因子水平的變化，以明確哪種手術(shù)方式對動物模型的干擾更小。