左卡尼汀聯(lián)合EPO和鐵劑治療大鼠腎性貧血

張風(fēng)賓，趙　飛，王英南，張瑞星*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，石家莊　050011； 2.河北省優(yōu)撫醫(yī)院內(nèi)科，石家莊　050051)

近年來(lái)在消化科首診的病例中，具有貧血伴惡心、嘔吐癥狀的病人日漸增多，確診后大多為腎功能衰竭患者。該病可以消化系統(tǒng)癥狀為首發(fā)表現(xiàn)，隨著病程進(jìn)展逐漸出現(xiàn)腎性貧血。

腎性貧血主要是因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)分泌不足或代謝障礙所致。目前臨床治療多采用補(bǔ)充外源性EPO，改善患者的貧血癥狀[1]。單純依靠EPO雖能改善貧血，但其治療效果受到諸多因素影響。其中有研究表明體內(nèi)儲(chǔ)存鐵的水平與EPO療效成正相關(guān)，EPO聯(lián)合鐵制劑治療可對(duì)腎性貧血具有明顯改善[2-4]。另外左卡尼汀與腎性貧血之間也有一定關(guān)聯(lián)性，左卡尼汀缺乏將會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)紅細(xì)胞壽命縮短，增加不良反應(yīng)的發(fā)生率[5-8]，并造成消化系統(tǒng)的損傷。已有研究表明EPO聯(lián)合左卡尼汀能顯著提高紅細(xì)胞生存期，明顯糾正腎性貧血[9]。

本研究以腎性貧血大鼠模型為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定左卡尼汀聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素和鐵劑治療后外周血特征指標(biāo)的變化，以及肝、腎和小腸的組織病理變化，評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥對(duì)腎性貧血及消化系統(tǒng)癥狀的改善效果，旨在為進(jìn)一步臨床推廣提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，6周齡，體重(180±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK (冀) 2013-003]。實(shí)驗(yàn)在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成[SYXK (冀) 2018-001],并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道主義關(guān)懷[IACUC Issue No.2017024]。

1.2　主要藥品與儀器

腺嘌呤(adenine，陜西永壽制藥有限公司)；重組人促紅細(xì)胞生成素(濟(jì)脈欣，華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，批準(zhǔn)號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S20053076)；琥珀酸亞鐵(速立菲，金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批準(zhǔn)號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10930005)；左卡尼汀(大連美羅中藥廠有限公司，批準(zhǔn)號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20103448)；全自動(dòng)生化分析儀LX20PRO(美國(guó)Beckman Coulter公司)；血細(xì)胞分析儀LH750(美國(guó)Beckman Coulter公司)；石蠟切片機(jī)Leica RM2125(上海徠卡儀器廠)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腎性貧血大鼠模型的建立

腺嘌呤溶于生理鹽水配制成25 mg/mL的混懸液，按照250 mg/kg的劑量灌胃，共24 d，第1～12天，每天給藥1次，第13天后隔天給藥[10-11]，給藥期間觀察大鼠精神狀況，毛發(fā)外形及體重變化情況。分別于造模前和造模后采集大鼠血液，檢測(cè)血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、外周血紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hgb)、紅細(xì)胞壓積(Hct)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、血鐵(Fe)、血清鐵蛋白(SF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(TS)水平。腺嘌呤給藥24 d后，從32只SD大鼠中隨機(jī)抽取2只，采用2%戊巴比妥鈉按0.3 mL/100 g體重劑量對(duì)SD大鼠腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后進(jìn)行解剖，采集腎臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及治療方案

據(jù)專(zhuān)家介紹，傳統(tǒng)毒品主要破壞人的免疫功能，損害心、肝、腎等臟器，過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致呼吸衰竭而亡；新型合成毒品則直接損害人的大腦細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)中毒反應(yīng)和精神分裂癥狀，過(guò)量服用將誘發(fā)急性精神障礙或急性心腦疾病，其危害是不可逆轉(zhuǎn)的。更值得警惕的是，新型毒品最大的危害表現(xiàn)在其傳播過(guò)程往往被偽裝成無(wú)害、無(wú)成癮性的東西，使接觸者“不以毒品為毒品”，這才是最可怕的地方。此外，互聯(lián)網(wǎng)加快了毒品傳播蔓延速度，導(dǎo)致毒品違法犯罪轉(zhuǎn)型升級(jí)，出現(xiàn)了從毒販通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)發(fā)布信息，到吸毒人員在網(wǎng)上集體視頻吸毒、交流吸毒體會(huì)、引誘發(fā)展新吸毒人員等一系列前所未見(jiàn)的現(xiàn)象。這讓保護(hù)青少年遠(yuǎn)離毒品的局面更為復(fù)雜。

腎性貧血大鼠模型建立后，將30只大鼠隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(A組)、EPO 聯(lián)合鐵劑組(B組)、左卡尼汀聯(lián)合EPO和鐵劑治療組(C組)，每組10只。A組：每天給予2 mL生理鹽水灌胃；B組：琥珀酸亞鐵溶于生理鹽水，按照300 mg/kg 劑量灌胃，每天一次；重組人促紅細(xì)胞生成素 200 IU/kg 尾靜脈注射，隔天一次[11]；C組：在EPO聯(lián)合鐵劑治療基礎(chǔ)上加用左卡尼汀，將左卡尼汀溶于生理鹽水，按照100 mg/kg 的劑量灌胃，每天一次[12]。給藥周期為3周。

1.3.3指標(biāo)測(cè)定

分別采集藥物治療前、治療結(jié)束后大鼠血液，每只大鼠均從內(nèi)眥靜脈采血3 mL，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)外周血紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hgb)、紅細(xì)胞壓積(Hct)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、血清鐵(Fe)、血清鐵蛋白(SF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(TS)指標(biāo)。治療3周采血后，采用2%戊巴比妥鈉按0.3 mL/100 g體重劑量對(duì)SD大鼠腹腔注射麻醉，待麻醉后立即剖檢取肝、腎及小腸，經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　腎性貧血大鼠模型建立

大鼠經(jīng)腺嘌呤作用后，均表現(xiàn)不同程度的精神萎靡、活動(dòng)減少、動(dòng)作遲緩、嗜睡、進(jìn)食量下降、體重減輕、消瘦、蜷縮、皮毛枯稿、干澀，大便稀薄不成型等癥狀。剖檢后，腎病理學(xué)檢查可見(jiàn)腎小球部分變形萎縮，邊界不清，組織細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，腎小管有不同程度的擴(kuò)張，均符合腎性貧血病理變化(圖1)。血液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤作用24 d后大鼠外周血RBC、Hgb、Hct、Fe、SF、TS水平均低于正常水平，而CRP、BUN、Scr高于正常水平，差異有顯著性(P< 0.05)(見(jiàn)表1)。以上結(jié)果均表明腎性貧血大鼠模型成功建立。

2.2　不同藥物組合治療后大鼠臨床癥狀觀察及病理學(xué)變化

經(jīng)不同藥物組合治療后，大鼠臨床癥狀均表現(xiàn)一定程度的改善，其中C組效果最佳。對(duì)照組大鼠臨床癥狀沒(méi)有改善。組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)，兩個(gè)治療組均有所減輕，表現(xiàn)為腎小球變形萎縮減少，腎小球纖維化癥狀減輕；肝細(xì)胞彌漫性水腫及點(diǎn)狀壞死情況減少；腸黏膜潰瘍減輕、萎縮面積縮小。其中C組改善最為明顯(圖2)。

2.3　不同藥物組合治療后大鼠血液相關(guān)指標(biāo)變化

經(jīng)不同藥物組合治療后，大鼠血液指標(biāo)亦有一定水平改善。結(jié)果可見(jiàn)，B 組、C 組的RBC、Hgb、Hct、Fe、SF、TS水平均有不同程度的上升， CRP 明顯降低，差異有顯著性(P< 0.05)，表明兩個(gè)治療組均能改善腎性貧血。兩個(gè)治療組間比較可見(jiàn)， C組的RBC、Hgb升高更明顯， CRP降低更明顯，二者差異有顯著性(P< 0.05)。以上表明EPO聯(lián)合左卡尼汀和鐵劑能進(jìn)一步改善治療效果(見(jiàn)表2)。

表1　大鼠造模前后血常規(guī)、血清鐵、鐵蛋白、腎功能指標(biāo)的水平

注：與造模前比較，aP< 0.05。

Note. Compared with the control group，aP< 0.05.

注：(A)正常大鼠；(B)模型大鼠。圖1　大鼠腎的病理學(xué)改變(HE×10)Fig.1　Pathological changes of the kidney tissues in a normal rat (A) and model rat (B). HE staining

注：(I)腎；(II)肝；(III)小腸。圖2　治療后大鼠腎臟、肝臟及小腸的組織學(xué)改變(HE×10)Note.(I)Kidney.(II)Liver.(III)Small intestine.Fig.2　Histology of kidney, liver and small intestine in the rats after treatment.HE staining.

組別GroupsA 組Group AB 組Group BC 組Group C紅細(xì)胞(×1012/L)RBC4.88±0.315.39±0.42a5.94±0.34ab血紅蛋白(g/ L)Hgb121.23±8.04148.66±12.14a159.79±11.76ab紅細(xì)胞壓積(%)Hct39.32±2.3342.61±2.19a43.10±4.25aC-反應(yīng)蛋白(mg/L)CRP2.68±0.222.01±0.23a1.77±0.14ab 血清鐵(μmol/ L)Fe42.43±3.2658.41±3.87a62.86±5.29a血清鐵蛋白(ug/L)SF128.80±27.87233.34±17.91 a257.17±20.52 a轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(%)TS 17.63±6.9736.15±10.64a42.60±11.45 a

注：與 A 組比較，aP< 0.05；與 B 組比較，bP< 0.05。

Note. Compared with the group A，aP< 0.05. Compared with the group B，bP< 0.05.

3　討論

近年來(lái)，慢性腎病 (chronic kidney disease, CKD) 發(fā)病率明顯上升，消化道癥狀是其最早的臨床表現(xiàn)，而腎性貧血是慢性腎臟病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。CKD可導(dǎo)致EPO自身生產(chǎn)能力下降，鐵缺乏，紅細(xì)胞壽命縮短，嚴(yán)重增加患者死亡率[13]。腎性貧血亦可導(dǎo)致胃腸粘膜萎縮及潰瘍的發(fā)生[14]。EPO單獨(dú)用藥雖然在臨床上治療腎性貧血取得了良好的效果，但其治療效果亦受到體內(nèi)儲(chǔ)存鐵劑及代謝毒物蓄積的影響，對(duì)于部分患者其治療結(jié)果仍然不理想[15]，且對(duì)消化系統(tǒng)癥狀的改善效果并不明顯。

本研究采用聯(lián)合用藥，結(jié)果顯示，兩個(gè)治療組RBC、Hgb、Hct、Fe元素水平有不同程度的上升， CRP下降明顯，表明兩個(gè)治療組均增加鐵的利用率，血紅蛋白合成增加，從而改善貧血的癥狀。在兩個(gè)治療組之間比較，左卡尼汀聯(lián)合EPO和鐵劑治療組效果更為理想。其可能的作用機(jī)制是：①通過(guò)給予左卡尼汀可減少紅細(xì)胞長(zhǎng)鏈脂酰-CoA堆積，延長(zhǎng)了紅細(xì)胞壽命。②左卡尼汀保護(hù)紅細(xì)胞免受自由基損傷，減緩紅細(xì)胞的氧化。③ EPO 可以增加紅細(xì)胞數(shù)量。④鐵劑的補(bǔ)充，進(jìn)一步提高血紅蛋白的合成。因此，EPO、左卡尼汀和鐵制劑的協(xié)同作用，可以有效地改善貧血癥狀。同時(shí)，有研究報(bào)道左卡尼汀能提高SOD的水平，降低MDA水平，消除了對(duì)消化道黏膜的氧化損傷，緩解了炎癥癥狀，這與本研究的結(jié)果一致[12]。

以上研究證明，左卡尼汀聯(lián)合EPO和鐵劑治療能明顯改善腎性貧血大鼠模型的臨床癥狀和消化系統(tǒng)癥狀，為臨床應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但臨床使用劑量、治療效果的關(guān)聯(lián)性及其安全性尚需進(jìn)一步研究論證。

參考文獻(xiàn)：