柏子仁甙對阿爾茨海默病模型大鼠的行為改善作用及其相關(guān)作用機(jī)制

索金紅，牟海軍，劉曉娟，姚福祥*，楊文廣

(1.通遼職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼　028000； 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸科，黑龍江 齊齊哈爾　161000； 3.內(nèi)蒙古通遼市醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 通遼　028000)

柏子仁為柏科植物側(cè)柏的種仁，具有養(yǎng)心氣，潤腎燥，益智寧神；燒瀝，澤頭發(fā)，治疥癬的功效[1]。近年來研究表明，柏子仁含柏子仁甙、柏木醇、雙萜類成分，還含脂肪油約14%，并含少量揮發(fā)油、皂苷、維生素A和蛋白質(zhì)等，脂肪油的主要成分為不飽和脂肪酸，占62.39%[2]。因此無論是祖國醫(yī)學(xué)理論還是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究均提示柏子仁有促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的作用。但是柏子仁是否對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)有治療和預(yù)防作用以及治療和預(yù)防的分子機(jī)制是什么，目前還未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此需要進(jìn)一步探索，為傳統(tǒng)醫(yī)藥的深入開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。本研究的目的就是通過Wistar大鼠雙側(cè)大腦海馬注射Aβ1- 42建立AD動(dòng)物模型，著重探討SPS對AD模型鼠認(rèn)知功能及海馬組織氧化性損傷與抗氧化作用的影響，進(jìn)一步闡明SPS對AD的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)作用效果。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雌性Wistar大鼠60只，24周齡，體重(300±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]，實(shí)驗(yàn)在通遼職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心及合約協(xié)作單位醫(yī)學(xué)院完成[SYXK(蒙)2016-0003]。所有使用的動(dòng)物依照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的相關(guān)規(guī)定獲得學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理審查證號2017002)。所有大鼠先用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)初篩，去除先天癡呆、體力差、游泳姿勢不良、視力困難者，剩下的即為合格大鼠，所有合格大鼠按照自然條件喂養(yǎng)，給予充足的食物和水，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中籠養(yǎng)，每籠3只，實(shí)驗(yàn)室保證良好的通風(fēng)及濕度，室溫保持在23℃。

1.2　主要試劑及儀器

超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH)、丙二醛試劑盒(MDA)(南京建成生物工程研究所，批號： 20160829， 20160801， 20160801)；UV754紫外可見分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德)；Bcl-2、survivin、Bax、Fas、caspase-3(武漢博士德)；二抗(武漢博士德)；5082型酶標(biāo)儀(TECAN)；Bio-Rad Model 785型電轉(zhuǎn)移儀。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組

選取20只經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選的正常無癡呆合格大鼠為正常對照組，將每只大鼠放于鼠腦立體定位儀上，雙側(cè)海馬穿刺，每側(cè)各一次性注入生理鹽水5 μL，穿刺坐標(biāo)為(以Bregma點(diǎn)為0點(diǎn)，AP 3.0 mm，ML 2.0 mm，DV 2.9 mm)，另選取50只合格大鼠，將每只大鼠放于鼠腦立體定位儀上，雙側(cè)海馬穿刺，穿刺坐標(biāo)為(以Bregma點(diǎn)為0點(diǎn)，AP 3.0 mm，ML 2.0 mm，DV 2.9 mm)，雙側(cè)海馬各一次性注射凝聚態(tài)Aβ1 425 μL，術(shù)后1周將50只大鼠應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選AD模型大鼠40只(選定標(biāo)準(zhǔn)為以正常對照組大鼠逃避潛伏期平均值的95%可信區(qū)間上限值為標(biāo)準(zhǔn)，將超出上限值者確定為AD模型造模成功)。將造模成功的AD模型大鼠隨機(jī)分為模型組和SPS干預(yù)組，每組20只。正常對照組和模型組給予生理鹽水5 mL+羧甲基纖維素鈉(500 mg/kg)灌胃，持續(xù)30 d，SPS干預(yù)組每天給予生理鹽水5 mL+SPS(300 mg/kg)灌胃[3]，持續(xù)30 d，每天喂養(yǎng)飲食及飼養(yǎng)條件與造模前一樣，30 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，然后斷頭取腦(含海馬)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2學(xué)習(xí)記憶能力測試[4]

用藥30 d后，全部60只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測定大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮測試房間保持安靜、清潔，整個(gè)測試期間，實(shí)驗(yàn)環(huán)境保持恒定。Morris水迷宮直徑120 cm，高60 cm，水深25 cm(高出站臺1 cm)，水溫控制在22℃～26℃，設(shè)置4個(gè)象限，站臺置于第3象限。池壁、水及平臺均用墨汁染黑不見水下平臺。迷宮上方安裝攝像頭，采集圖像輸入計(jì)算機(jī)。

1.3.3海馬組織MDA、GHS含量及SOD活力測定[5]

將正常對照組、模型組、SPS干預(yù)組全部60只大鼠用20%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取出完整大腦。將大鼠腦置冰盤上，于解剖顯微鏡下仔細(xì)剝除腦膜，沿中線胼胝體切成兩半，將半腦翻過，從腹側(cè)面掀開大腦皮層，暴露靠近小腦側(cè)的里面月牙狀組織，即為海馬，用彎鑷取出。保留海馬組織，用濾紙吸干水分，天平稱重，然后加組織重量9倍的4℃生理鹽水，制成組織勻漿液，冷凍離心機(jī)2500 r/min離心10 min，取離心后的上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1%的海馬組織勻漿溶液。將準(zhǔn)備好的海馬組織上清液取樣，放在95℃水浴箱中40 min，然后放入離心機(jī)中3500 r/min離心10 min，取離心后的上清液，測各管吸光度。含量測定(nmol/mgprot)=(測定管吸光度-空白管吸光度)÷(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(nmol/mL)÷蛋白含量(mgprot/mL)。SOD活力(U/mgprot)=(對照管吸光度-測定管吸光度) ÷(對照管吸光度×50%)×反應(yīng)液總體積÷取樣量(mL) ÷ 蛋白含量(mgprot/mL)。

1.3.4Western Blotting

將3組大鼠海馬組織從液氮罐中取出，取出的3組海馬組織塊先用冷PBS洗滌3次，去除血污，剪成小塊放在勻漿器中，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min， 4℃ 15 000 r/min 5 min離心，得到的上清為蛋白樣品，然后應(yīng)用BCA法檢測樣本蛋白濃度。電泳及電轉(zhuǎn)、抗體檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組所有大鼠在5 d內(nèi)學(xué)會尋找平臺，潛伏期較正常對照組和SPS干預(yù)組明顯延長(P< 0.01)。模型組搜索時(shí)間較正常對照組、SPS組搜索時(shí)間明顯延長；模型組搜索距離百分比較正常對照組、SPS干預(yù)組搜索距離百分比明顯降低(P< 0.01)；SPS干預(yù)組較正常對照組搜索時(shí)間明顯延長，SPS干預(yù)組較正常對照組搜索距離百分比明顯降低(P< 0.01)(見表1)。

2.2　3組大鼠海馬MDA、GSH含量及SOD活力的比較

3組大鼠海馬MDA、GSH含量及SOD活力的比較見表2，SPS干預(yù)組MDA含量明顯低于模型組，而高于正常對照組(P< 0.01)；GSH含量SPS干預(yù)組明顯高于模型組，低于正常對照組(P< 0.01)；SOD活力SPS干預(yù)組明顯高于模型組，低于正常對照組(P< 0.01)。

表1　3組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預(yù)組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

表2　3組大鼠海馬MDA、GHS含量及SOD活力的比較

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預(yù)組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

表3　3 組大鼠海馬組織凋亡相關(guān)因子蛋白表達(dá)比較(相對光密度)

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預(yù)組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

2.3　3組大鼠海馬Bcl-2、Survivin、Bax、Fas、Caspase-3蛋白的表達(dá)

SPS干預(yù)組Bcl-2蛋白表達(dá)較模型組上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時(shí)與對照組比較Bcl-2蛋白表達(dá)下降(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預(yù)組survivin蛋白表達(dá)較模型組上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時(shí)與對照組比較survivin蛋白表達(dá)下降(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預(yù)組Bax蛋白表達(dá)較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時(shí)與對照組比較Bax蛋白表達(dá)上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預(yù)組Fas蛋白表達(dá)較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時(shí)與對照組比較Fas蛋白表達(dá)上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預(yù)組caspase-3蛋白表達(dá)較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時(shí)與對照組比較caspase-3蛋白表達(dá)上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)(見表3和圖1)。

圖1　SPS對模型鼠海馬Bcl-2、Survivin、Bax、Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.1　Effect of SPS on the expression of Bcl-2, survivin, Bax, Fas and caspase-3 proteins in the hippocampus of model rats

3　討論

AD模型組搜索時(shí)間較正常對照組明顯延長，兩組比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其表現(xiàn)主要體現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能的損害，與臨床上阿爾茨海默病病人的表現(xiàn)相符，結(jié)合我們應(yīng)用的Aβ1- 42注射模型說明Aβ?lián)p害是阿爾茨海默病發(fā)病的主要機(jī)制，也進(jìn)一步說明此模型可以作為探索AD病因、尋找AD治療藥物較理想的模型。因此我們采取此模型是符合阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制并且其臨床表現(xiàn)也符合人類AD的臨床表現(xiàn)，為我們下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了可靠的模型基礎(chǔ)。在我們的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)測試中比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也說明SPS對阿爾茨海默病模型鼠的認(rèn)知功能具有保護(hù)作用。余正文等[6-8]通過活性篩選發(fā)現(xiàn)，柏子仁石油醚提取物對雞胚背根神經(jīng)節(jié)突起的生長有輕度促生長作用。這些物質(zhì)的促生長作用有兩種可能性：一是促進(jìn)神經(jīng)生長因子NGF的合成、分泌及釋氧化應(yīng)激反應(yīng)對神經(jīng)元具有直接的毒性作用。由于AD患者中內(nèi)源性氧化作用增強(qiáng)，而內(nèi)源性和外源性的抗氧化作用減弱，加上中樞神經(jīng)系統(tǒng)豐富的脂質(zhì)成分，因此神經(jīng)元細(xì)胞膜極易遭受自由基的損傷，導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)破壞和幾種乙醛產(chǎn)物的產(chǎn)生；同時(shí)自由基的幾種成分，特別是羥自由基可以直接破壞核酸，導(dǎo)致染色體的斷裂、底物的改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性；此外自由基也可以直接破壞線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致線粒體的變性。這三種因素導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡甚至是死亡，這可能是導(dǎo)致AD患者神經(jīng)元丟失的原因。另外氧化應(yīng)激還與其他致病因素協(xié)同作用進(jìn)一步加重AD的病理過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，SPS干預(yù)組MAD的含量與模型組比較明顯降低，說明SPS具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，從而進(jìn)一步抑制活性自由基的產(chǎn)生。由于自由基生成減少，由自由基直接造成的神經(jīng)元細(xì)胞膜、DNA的直接損傷以及線粒體呼吸鏈的損傷會明顯減少，神經(jīng)元的凋亡必然減少，從而發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)SPS干預(yù)組GSH的含量和SOD活力均較模型組明顯升高，這進(jìn)一步說明SPS不僅可以通過調(diào)節(jié)自由基的代謝，也同時(shí)可以調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)，加速自由基的清除，減少自由基在神經(jīng)元內(nèi)的蓄積，從而對AD模型鼠的海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。但是SPS是直接從基因水平調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激及抗氧化系統(tǒng)的蛋白質(zhì)代謝還是間接的作用尚不清楚。筆者推測SPS的作用機(jī)制如下：由于SPS促進(jìn)神經(jīng)生長因子NGF合成、分泌及釋放，且其具有神經(jīng)生長因子功能，能在基因水平促進(jìn)抗氧化系統(tǒng)蛋白質(zhì)的合成，從而促進(jìn)清除自由基，其亦可通過促進(jìn)線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白質(zhì)的合成抑制自由基產(chǎn)生；SPS具有拮抗神經(jīng)炎癥的作用，可減輕神經(jīng)元損害[9-10]。

在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SPS組海馬組織Bax、Fas、caspase-3的表達(dá)較模型組比較明顯降低，兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SPS具有拮抗凋亡的作用，并且細(xì)胞內(nèi)途徑和細(xì)胞外途徑均可以部分拮抗，同時(shí)在我們的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)SPS組海馬survivin和Bcl-2的表達(dá)明顯升高，說明SPS還有促進(jìn)拮抗凋亡機(jī)制的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[11]在新生小豬低氧缺血模型中SPS在10 mg/d應(yīng)用時(shí)可以明顯減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)[12]SPS可以明顯減少腦梗死體積百分比，且在海馬和皮層單位面積TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，雖然這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)是在缺血中發(fā)現(xiàn)的直接證據(jù)，也與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，也從另外一個(gè)角度證實(shí)了SPS抗神經(jīng)元凋亡的效果。SPS調(diào)節(jié)凋亡是從阻止凋亡通路和激活抗凋亡通路發(fā)揮雙重作用，但是SPS抗凋亡的具體機(jī)制不是很清楚，推測可能與以下機(jī)制有關(guān)，一是拮抗海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化系統(tǒng)的活性，這在我們前面的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)被證實(shí)；二是SPS可以抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[13]；三是調(diào)節(jié)電壓門控鈣通道和興奮性谷氨酸受體，減輕細(xì)胞凋亡信號的觸發(fā)因素[14]；四是直接抑制APP的合成；五是抑制了乙酰膽堿酯酶的活性。但是在我們的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，SPS組海馬組織Bax、Fas、caspase-3的表達(dá)與正常對照組比較仍然是較高，survivin和Bcl-2的表達(dá)較正常對照組低，這說明AD發(fā)病機(jī)制中神經(jīng)元的凋亡是一個(gè)多途徑，多因素的結(jié)果，SPS還不能完全拮抗凋亡在AD發(fā)病中的作用，這指導(dǎo)

我們在臨床應(yīng)用中，要聯(lián)合用藥。同時(shí)我們實(shí)驗(yàn)中難以選擇一個(gè)特異性的凋亡阻滯劑進(jìn)行對照來進(jìn)一步評價(jià)，需要在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

因此，氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的減弱必然參與了阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制，并且貫穿其發(fā)病與發(fā)展的整個(gè)過程，SPS在阿爾茨海默病模型鼠中表現(xiàn)出了較好的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，這必將為AD的治療帶來新的希望，同時(shí)也必將擴(kuò)展祖國醫(yī)學(xué)的深入開發(fā)利用。