氣管插管和口咽吸入兩種方法吸入二乙酰構(gòu)建閉塞性細支氣管炎小鼠模型的比較研究

鄧華蓉，龔財惠，袁小平，閆 莉，耿 剛，吳嘉彬，代繼宏

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院：1. 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室；2. 肺功能室；3. 呼吸中心一病房，重慶 400014)

閉塞性細支氣管炎( bronchiolitis obliterans, BO)是氣道炎性損傷所致的慢性呼吸道疾病，表現(xiàn)為小氣道纖維增殖性病變使管腔狹窄，并最終閉塞，患者出現(xiàn)進行性、不可逆的氣流受阻，嚴重威脅人類健康，尚無有效的防治手段，發(fā)病機制不清[1]。

構(gòu)建簡易的動物模型是研究BO發(fā)病機制及探討治療靶點的重要手段。目前，構(gòu)建BO模型的方法主要有骨髓移植、肺移植、病毒感染及化學(xué)藥物，上述的各種造模方法都存在一定優(yōu)劣。針對不同病因引起的BO需要不同的動物模型。2002年《新英格蘭雜志》報道爆米花工廠工人發(fā)生BO者，考慮與暴露于食品添加劑中的重要成分二乙酰(diacetyl, DA)有關(guān)，隨后學(xué)者采用各種途徑吸入DA的方法構(gòu)建BO動物模型。本研究組前期利用口咽吸入DA的方法構(gòu)建了C57BL/6小鼠的BO動物模型，但發(fā)現(xiàn)該方法存在模型不穩(wěn)定、死亡率高、不易復(fù)制等缺點。近年有學(xué)者采用氣管插管給予DA成功構(gòu)建BO的大鼠模型。因此，本研究對口咽吸入和氣管插管給予DA兩種造模方法進行比較研究，以期探究出一種易于操作，成功率高的BO小鼠模型的構(gòu)建方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組選取購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心6～8周清潔級雄性C57BL/6小鼠，小鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實驗動物研究中心SPF動物房；實驗時室溫(22±1)℃，濕度(47±2)%。實驗操作均按照實驗動物指南進行。SPF級C57BL/6雄性小鼠(6～8周)按隨機數(shù)字表法分為4組：口咽吸入組(oropharyngeal aspiration, OPR)、氣管插管組(intratracheal instillation, ITI)、口咽吸入對照組(OPR-CON)、氣管插管對照組(ITI-CON)，每組10只，采用口咽吸入和氣管插管一次性給予DA或蒸餾水(ddH2O) (400 mg/kg，327 mg/mL)后，飼養(yǎng)于SPF級動物中心，至第7天收集標本。每天于同一時間點觀察小鼠一般情況及體質(zhì)量至第7天，并做好記錄。

1.2處理方法DA濃度的稀釋：DA與ddH2O 1∶2混合，把原質(zhì)量濃度981 mg/mL稀釋為327 mg/mL。

OPR組：實驗當天稱體質(zhì)量，100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔麻醉，實驗員用左手固定住小鼠，右手用眼科鑷子將小鼠的舌頭從口中輕輕牽出，另外助手左手捏住小鼠鼻子，右手滴入DA(按400 mg/kg，327 mg/mL根據(jù)當日體質(zhì)量計算)一次，動物清醒后，常規(guī)喂養(yǎng)。OPR-CON組：操作同OPR組，ddH2O代替DA。ITI-CON組：實驗當天稱體質(zhì)量，100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔麻醉，固定于小鼠板上，用眼科鑷子將小鼠的舌頭從口中輕輕牽出，用自制的插管裝置，在發(fā)光挖耳勺前置發(fā)光裝置的引導(dǎo)下插入插管裝置，拔出插管裝置前的留置針，待小鼠呼吸平穩(wěn)后緩慢滴入ddH2O(按400 mg/kg，327 mg/mL根據(jù)當日體質(zhì)量計算)一次，動物清醒后，常規(guī)喂養(yǎng)。ITI組：操作同ITI-CON組，ddH2O代替DA。

1.3BALF的灌洗及細胞計數(shù)兩種方法給藥后 7 d 后，小鼠用100 g/L的水合氯醛麻醉，眼球取血處死，充分暴露氣管和胸腔。用手術(shù)鉗加緊左肺門，從氣管插入留置針，拔出針芯并固定，灌入預(yù)先預(yù)冷的PBS，3次，每次0.5 mL，回收率大于80%證明灌注充分。2 500 r/min 4 ℃離心5 min，分裝收集上清液。細胞沉渣用1 mL消毒后的PBS稀釋，充分混勻后取20 μL進行細胞計數(shù)。剩余的2 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清液，涂片，晾干后瑞氏染色細胞分類計數(shù)。

1.4肺功能測定第7天用無創(chuàng)肺功能體描儀行小鼠氣道高反應(yīng)性檢測，先測定基礎(chǔ)肺功能值，再將待檢測小鼠依次霧化吸入乙酰甲膽堿(Mch)，由低質(zhì)量濃度開始(0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)，每個濃度霧化3 min、休息2 min，連續(xù)記錄5 min取其平均值。用增強呼氣間歇(enhanced pause, Penh)值代表霧化不同質(zhì)量濃度乙酰甲膽堿后的氣道高反應(yīng)性。

1.5肺及腸組織HE染色、Masson染色及圖像分析取4組小鼠左肺組織及腸道組織，置于100 g/L的中性甲醛中固定(至少大于24 h)，經(jīng)脫水，石蠟包埋，切成4 μm的薄片，貼附在載薄片上，60 ℃烤箱內(nèi)烘烤24 h后，分別行蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色，光鏡下觀察病理改變。

2 結(jié) 果

2.1口咽吸入和氣管插管給予美藍后，美藍在肺部的分布情況小鼠分別經(jīng)口咽吸入和氣管插管給予美藍，可以觀察到通過口咽吸入的方法，美藍主要停留在氣管，肺部分布不均勻，且一部分吸入到胃腸道，而氣管插管給藥可以看到，美藍均勻分布在左右兩肺，且未進入胃腸道(圖1)。

圖1 兩種方式給予美藍后肺和消化道的分布情況Fig.1 Distribution of methylene blue in the lung and digestive tract

2.2小鼠給藥后的一般情況OPR組給予DA后，2 d后小鼠可見喘息、呼吸加快、抓口鼻、點頭樣等表現(xiàn)，4 d時上述癥狀緩解，但仍有呼吸加快、點頭樣呼吸等反應(yīng)；OPR-CON組無以上癥狀。氣管插管給予DA后，2 d后實驗組小鼠可吼喘、呼吸加快、抓口鼻、點頭樣等表現(xiàn)，4 d時上述癥狀好轉(zhuǎn)，但仍有呼吸加快、點頭樣呼吸等反應(yīng)；ITI-CON組無以上癥狀。

2.3小鼠體質(zhì)量的變化OPR組小鼠體質(zhì)量于第1～2天下降最明顯，從第3天開始體質(zhì)量下降趨勢減緩，但監(jiān)測其體質(zhì)量至第7天時仍低于OPR-CON組(P<0.001，圖2)。ITI組小鼠體質(zhì)量于第1～2天下降明顯，從第3天開始體質(zhì)量下降趨勢減緩，第7天時氣管插管組體質(zhì)量低于ITI-CON組(P<0.001，圖2)。OPR組體質(zhì)量下降程度高于ITI組(P<0.001，圖2)。

2.4各組小鼠的生存率及造模成功率實驗過程中，OPR組觀察至第7天時，共死亡6只，分別是第2天死亡1只，第3天死亡2只，第4天死亡2只，第5天死亡1只，剩余4只，有2只有明顯病理改變，2只表現(xiàn)正常，至第7天時OPR組的生存率僅為40%(圖3)，造模成功率為20%(明顯病理改變數(shù)/每組小鼠的總數(shù))。ITI組有3只死亡，分別死于第3天、5天、6天，剩余7只中的6只有明顯的病理改變，1只無明顯病理改變，至第7天時ITI組生存率為70%(圖3)，造模成功率達60%。OPR-CON組和ITI-CON生存率100%。

圖2 兩種方法構(gòu)建BO小鼠模型的體質(zhì)量變化Fig.2 Weight change in two-method resulted BO murine model

2.5各組小鼠氣道高反應(yīng)變化OPR組與OPR-CON組相比，第7天肺功能(霧化Mch質(zhì)量濃度為50 mg/mL時)Penh升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖4)。ITI組與ITI-CON組相比，第7天的肺功能(霧化Mch質(zhì)量濃度為50 mg/mL時)Penh升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖4)。且ITI組(霧化Mch質(zhì)量濃度為50 mg/mL時)Penh高于OPR組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖4)。ITI-CON組與OPR-CON組的肺功能無差異。

圖3 兩種方法構(gòu)建BO小鼠模型的生存率Fig.3 Survival rate of two-method resulted BO murine model

圖4 兩種方法構(gòu)建BO小鼠模型的肺功能改變Fig.4 Changes in lung function in two-method resulted BO murine model

2.6各組小鼠BALF中細胞總數(shù)及細胞分類計數(shù)BALF中炎癥細胞總數(shù)及分類計數(shù)可見，第7天時OPR組和ITI組BALF中的細胞總數(shù)高于與對照組(P<0.001)，其中以中性粒細胞總數(shù)增高為主(P<0.001，圖5)，且TIT細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)高于OPR組(P<0.001，圖5)，兩對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.7各組小鼠肺組織病理學(xué)改變通過不同方式給予DA(400 mg/kg)1次后，HE染色可以看到兩種給藥方式都可以產(chǎn)生典型的BO病理改變。第7天時氣管HE可以看到：OPR組氣道上皮完整性破壞，出現(xiàn)異常的上皮增生，上皮下炎癥細胞浸潤(圖6B)；ITI組氣道上皮受損，管腔內(nèi)出現(xiàn)肉芽樣組織(圖6D)。第7天時肺組織HE可以看到：OPR組小氣道完全阻塞，上皮細胞脫落，肺出血，肺泡間隔增厚，管周大量炎癥細胞浸潤(圖6F)；ITI組細支氣管管腔阻塞，上皮細胞脫落，管周大量炎癥細胞浸潤，大氣道出現(xiàn)肉芽樣組織(未在圖中展示)(圖6H)。

圖5 兩種方法構(gòu)建BO小鼠模型中BALF中炎癥細胞Fig.5 Inflammatory cells in BALF of two-method resulted BO murine model

2.8Masson染色結(jié)果第7天時肺組織Masson染色顯示OPR組和ITI組管周大量膠原蛋白沉積，出現(xiàn)類纖維化表現(xiàn)(圖7)。

2.9造模組腸道病理改變OPR組，腸道HE顯示腸道上皮脫落壞死，而ITI組及對照組(OPR-CON，ITI-CON)腸道形態(tài)正常(圖8)。

3 討 論

閉塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans, BO)是以進行性呼吸困難及氣流受阻為表現(xiàn)的肺細支氣管閉塞性疾病，早在1901年就有學(xué)者報道。本病是一個病理學(xué)概念，病理特征為細支氣管及周圍炎癥、纖維增生，導(dǎo)致管腔閉塞[1-2]。目前BO的病因、發(fā)病機制還不清楚，深入探討該病的發(fā)病機制、預(yù)防及治療受到一定的限制。因此，構(gòu)建適宜的動物模型是機制研究及探尋預(yù)防及治療手段的重要研究方法。

導(dǎo)致BO的病因較多，如器官移植后(尤其是心、肺移植，骨髓移植等)、感染、吸入有毒有害氣體等。據(jù)此，目前構(gòu)建BO動物模型的方法包括異位/原位氣管移植[3-4]、異位/原位肺移植[3-4]、造血干細胞移植[5]、持續(xù)高頻霧化吸入化學(xué)或有毒物質(zhì)(如DA、萘、氯氣，二氧化硫)[6]等?；谝浦驳膭游锬Ｐ托枰募夹g(shù)條件較高，且移植后的BO模型和其他原因?qū)е翨O模型發(fā)病機制存在差異[7]。因此，建立適宜的非移植后BO模型對BO的機制研究具有重要意義。

圖6 各對照組與造模組第7天的氣管和肺組織病理改變Fig.6 Histopathological changes in two-method resulted BO murine model (HE, ×200)

圖7 兩種方法構(gòu)建的BO小鼠模型第7天出現(xiàn)的類纖維化表現(xiàn)Fig.7 Airway fibrosis of two-method resulted BO murine model (blue: collagen, ×200)

圖8 兩種方法構(gòu)建的BO小鼠模型腸道的病理改變Fig.8 Histopathological changes of the intestine in two-method resulted BO murine model (HE, ×200)

吸入有毒有害氣體是導(dǎo)致BO的重要原因之一，如：文獻報道國外爆米花工廠工人，長期吸入爆米花香味添加劑DA后，出現(xiàn)新發(fā)的、無法解釋的阻塞性氣流受限，被確診為BO患者[8]。因此，通過氣道給藥方式制備的BO模型，更能為這類疾病的研究提供依據(jù)。文獻報道，分別采用高頻霧化吸入氯氣或二氧化硫及二乙酰構(gòu)建BO 模型中，因霧化過程中吸入有毒氣體的多少存在個體差異，且霧化吸入化學(xué)物質(zhì)污染環(huán)境，損壞病變主要在上呼吸道[9-11]。近年有學(xué)者在大鼠中采用氣管插管的方法注入DA，成功構(gòu)建BO模型[12]。相比霧化吸入，此方法造模更穩(wěn)定，避免過度上呼吸道損傷，模型更接近臨床的BO表現(xiàn)，但目前敲除鼠都采用遺傳背景清楚的C57BL/6小鼠，給BO的研究帶來限制。

在小鼠中采用氣管插管的方法給予博來霉素已成功構(gòu)建成熟的肺纖維化模型[13]。因此，本研究采用C57BL/6小鼠制備BO模型，該小鼠價格較低、遺傳背景清楚、試劑來源廣泛。本研究組前期利用口咽吸入DA的方法構(gòu)建了C57BL/6小鼠的BO動物模型[14]。但該方法存在模型不穩(wěn)定、死亡率高、不易復(fù)制等缺點。因此，本實驗比較口咽吸入和氣管插管兩種給藥方式，以期探討出一種穩(wěn)定地且易于構(gòu)建的BO小鼠模型。

本實驗發(fā)現(xiàn)，無論采用口咽吸入給藥或氣管插管給藥造模，第7天后都可以出現(xiàn)氣道高反應(yīng)，BALF中炎癥細胞數(shù)目增加，且以中性粒細胞浸潤為主，HE染色顯示氣道管腔閉塞，上皮脫落，管周大量炎癥細胞浸潤，上皮下大量膠原物質(zhì)沉積類纖維化等改變。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，采用口咽吸入給藥小鼠模型不穩(wěn)定，考慮與操作者的實驗操作差異化較大有關(guān)，導(dǎo)致吸入DA的劑量不易控制。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，口咽吸入給藥組小鼠體質(zhì)量下降明顯、生存率低，病理發(fā)現(xiàn)小鼠腸道上皮壞死，考慮為口咽吸入DA進入消化道所致。而氣管插管保證了DA進入氣道劑量恒定、均一，避免對消化道上皮的損傷。

因此，通過本實驗可以得出采用氣管插管一次性給予DA(400 mg/kg，327 mg/mL)，閉塞性細支氣管炎小鼠模型建立良好，小鼠死亡率低，成功率高，值得實驗推廣使用。

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