一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)細胞自噬的影響

黃語悠 房亞蘭 師文娟 劉克建 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中心實驗室 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100053)

缺血性腦血管病是導致死亡的重要原因之一，也是導致肢體殘疾的重要因素[1]。腦缺血/再灌注損傷涉及一系列復雜的病理過程，但具體目前機制仍不明確。其中，氧化應激損傷在腦缺血再灌注損傷中扮演了重要角色[2]。因此，缺血性卒中的氧化應激損傷與腦保護策略是目前的研究熱點之一[3]。

自噬可以通過產生游離氨基酸和脂肪酸來維持細胞功能，并通過去除損傷的細胞器和蛋白質保持細胞健康，從而使細胞在營養(yǎng)限制條件下存活，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種重要機制，是細胞得以保持健康的重要原因之一[9-10]。然而，過量的自噬也會導致過度的自我消化或引發(fā)細胞凋亡而導致細胞死亡[10-11]。研究者[12]認為神經元死于缺血性損傷后的壞死或凋亡。然而，新的研究[13]表明，缺血再灌注也可以激活自噬性細胞死亡，而NO在多種細胞中被證實對自噬信號產生了不同的影響，NO通過上調自噬來防止I/R誘導的肝損傷，但同時，也有研究[14]顯示NO可以造成缺血再灌注后的腦損傷與心肌損傷。血管再通是目前針對缺血性卒中最有效的治療方法，氧化應激和自噬在缺血再灌注過程中發(fā)揮的作用對于缺血性卒中的治療和預后有著重要意義。本課題組[7]前期研究顯示延遲并減弱NO產生可對大腦缺血再灌注損傷產生保護作用，但自噬在其中扮演了怎樣的角色目前尚不明確。因此，本研究采用大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO) 再灌注模型大鼠，觀察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制劑(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)對大鼠腦缺血再灌注后24 h NO和自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的表達產生的影響，從而進一步探討NO在腦缺血再灌注過程中扮演的角色，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠，體質量280～320 g，北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001，于SPF級動物實驗室恒溫飼養(yǎng)，術前12 h禁食水。將18只大鼠采用數字表法隨機分為3組：假手術(Sham)組；MCAO組；MCAO+L-NAME組。L-NAME溶于0.9%(質量分數)氯化鈉注射液中，于術前30 min腹腔注射給藥(1 mg/kg)，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。

1.2 主要儀器設備

小動物麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、手術顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、反饋式溫度調節(jié)儀(CMA 150 Carnegie Medicin公司瑞典)、小動物呼吸機(Harvard Apparatus 683，Harvard Apparatus公司，美國)雙極電凝器(德威，DEVEL，ACC100)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.3 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；水合氯醛(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院)；L-NAME(Sigma公司，美國)；3-NT抗體(Abcam公司，英國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)；LC3B抗體(CST公司，美國)等。

1.4 動物模型制作

MCAO大鼠模型按照改良Zea Longa法制備。將恩氟烷混合于70%(體積分數) N2O、30%(體積分數) O2中，用5%(體積分數)恩氟烷誘導麻醉后改用面罩吸入2%(體積分數)恩氟烷維持麻醉。于大鼠頸部沿正中線切口，分離右側的頸總動脈、結扎并凝斷頸外動脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動脈殘端插進頸內動脈，到達距頸外動脈和頸內動脈分叉約18 mm處。術中檢測大鼠心率、血壓，并使用反饋性控溫毯監(jiān)測術中大鼠肛溫，維持體溫在 (37.0±0.5)℃。缺血90 min后，將線栓拔出進行再灌注。術后大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，自由進食飲水。

1.5 免疫熒光雙標

各組大鼠于再灌注后24 h，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，包埋冰凍，行連續(xù)冰凍切片(厚度為20 μm)。首先將腦組織冰凍切片經4%(質量分數)多聚甲醛固定10 min，PBS洗后，用含有0.2%(體積分數) TritonX-100的PBS孵育約10 min，PBS洗后，用5 %(體積分數)的山羊血清在室溫下封閉30 min，滴加一抗(3-NT 1∶400， LC3B 1∶400，Beclin1 1∶400)，4 ℃孵育一抗過夜。次日將切片取出，PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300)，在室溫下避光孵育1 h。PBS洗后，最終用DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)封片。在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 L-NAME抑制MCAO 大鼠腦缺血半暗帶區(qū) LC3B的表達

免疫熒光染色結果顯示，Sham組大鼠大腦中與缺血半暗帶相對應的腦區(qū)偶見LC3B陽性的紅色熒光染色，而MCAO組大鼠缺血側額顳葉皮質及紋狀體可見大量LC3B陽性細胞。與Sham組相比，MCAO組大鼠LC3B陽性細胞數量明顯增多；與MCAO組相比，L-NAME組大鼠缺血半暗帶區(qū)LC3B陽性細胞數量明顯減少(圖1 A)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1 B)。

2.2 L-NAME抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1的表達

免疫熒光結果顯示，Sham組大鼠腦組織有少量Beclin1蛋白陽性細胞，散見于海馬區(qū)與額頂顳葉皮質。MCAO組大鼠腦組織于鏡下可見大量紅色熒光，大腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽性細胞數量較Sham組明顯增高。L-NAME組大鼠腦組織切片缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽性細胞數量較MCAO組明顯減少(圖2 A)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2 B)。

圖1 L-NAME抑制大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區(qū)與3-NT相關的Beclin1表達Fig.1 Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) inhibits the production of 3-nitrotyrosine (3-NT)-related Beclin1 in the ischemic penumbra of cortices of middle cerebral artery occlusion (MCAO) rats 24 h after reperfusion

圖2 L-NAME降低大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區(qū)與3-NT相關的LC3B表達Fig.2 Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) inhibits the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT)-relatedLC3B in the penumbra of middle cerebral artery occlusion (MCAO)rats at 24 h after reperfusion

2.3 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3B、Beclin1分別與3-NT共定位

通過免疫熒光雙標可見，LC3B和Beclin1陽性細胞均呈紅色熒光，3-NT陽性細胞為綠色熒光，細胞核染色為藍色熒光。合并圖像后，綠色熒光與紅色熒光重合，說明LC3B和Beclin1與3-NT共定位，提示缺血再灌注后LC3B與Beclin1蛋白表達量的增加與NO的過量產生具有相關性(圖1、2)。

3 討論

腦缺血后的神經損傷機制十分復雜，因此至今仍缺乏針對病因的有效治療[1]。氧化應激是腦缺血再灌注過程中神經損傷的重要因素，其與神經元凋亡之間的關系一直是腦保護劑研究的重點方向[3]。近年來，有研究[14]顯示，除了神經元凋亡，神經元的自噬性細胞死亡與氧化應激損傷之間也有著密切的聯(lián)系，可能是腦缺血損傷產生的一個重要因素。NO與自噬的相關性在心血管疾病中的研究較多，但其在腦血管疾病中的關系目前仍存在爭議，有研究[13]認為自噬通過吞噬受損細胞器緩解缺血再灌注引起的氧化應激損傷；但也有研究[11,14]觀察到NO與自噬具有協(xié)同作用，加重缺血再灌注損傷。本研究通過腹腔注射NOS抑制劑L-NAME抑制缺血再灌注后大鼠腦內NO的產生，觀察NO的產生是否影響大鼠腦內自噬的激活，以探究NO與自噬的直接關系。

腦缺血、缺氧后多種信號分子參與了自噬激活[13]。作為調控自噬小體合成的上游蛋白，Beclin1是自噬小體形成過程必不可少的分子，對檢測組織內自噬作用有著重要的意義[11]。已知上調Beclin1的表達可以激活自噬作用，體外培養(yǎng)的Beclin1缺失的細胞自噬減少。在自噬形成的初始階段[9]，Beclin1通過與PI3K形成復合體調節(jié)自噬相關基因(autophagy related gene, Atg)表達的Atg蛋白在自噬前體中的位置。Atg8家族的LC3蛋白可以誘導自噬體雙層膜結構的形成，因此LC3一直存在于自噬體的膜結構中，作為自噬體形成的標志。哺乳動物體內的LC3蛋白存在3種不同的亞型(LC3A、LC3B、LC3C)，這3種亞型的LC3蛋白在不同的組織和細胞內分布情況不同，但目前缺少足夠的研究結果對其進行詳細的區(qū)分，現階段通常通過檢測組織中LC3B蛋白含量代表組織內LC3蛋白的表達量[15]。本研究結果顯示，在缺血再灌注24 h，自噬相關蛋白Beclin1和LC3B均可與ONOO-共定位，提示NO與腦缺血再灌注過程中腦組織自噬的激活存在相關性。

研究[11]表明，在大腦缺血再灌注幾小時后，自噬相關蛋白表達量上升，參與缺血再灌注損傷的多個病理生理過程。但是自噬在腦缺血再灌注損傷過程中所扮演的角色仍存在爭議。當自噬適度激活時[15]，可促使細胞內蛋白質細胞器等垃圾物質降解，產生氨基酸、能量等補充細胞內物質不足，對細胞存活具有促進作用。Ye等[16]的研究表明，自噬的激活對新生缺氧缺血性腦病大鼠產生神經保護作用。而當自噬過度激活時，可破壞細胞內部穩(wěn)態(tài)，擾亂細胞的正常代謝，導致細胞裂解，引起自噬性細胞死亡。Feng等[11]的研究結果顯示，抑制自噬作用對腦缺血損傷具有保護作用。但是缺血再灌注后自噬表達的上調是否與NO的產生直接相關，目前的研究仍缺乏明確的證據。故而在本研究中，于MCAO術前30 min經腹腔注射NOS抑制劑，以減少缺血再灌注后大鼠腦內NO的產生。筆者觀察到，作為NOS抑制劑，L-NAME可有效抑制大鼠MCAO模型中由NO介導的蛋白質損傷。同時，L-NAME也明顯降低了MCAO大鼠腦組織中自噬相關蛋白LC3B和Beclin1的表達量，但仍高于Sham組。文獻[17]報道L-NAME可以保護腦缺血損傷，改善MCAO大鼠的神經功能。因此，本研究推測NO介導的蛋白質損傷導致Beclin1和LC3B的表達應激性上調，且此時自噬的表達的上調可能加重了腦損傷。L-NAME通過抑制NOS活性，減少NO的產生，直接避免神經元的氧化應激損傷；同時，氧化應激損傷的減弱也避免了自噬的進一步激活，起到了間接的神經保護作用[18]。

了解再灌注介導的氧化應激和自噬之間的相互作用，以明確缺血性腦損傷的機制，對于基于tPA溶栓治療的腦保護策略研究具有重要意義，且具有一定的臨床價值。本研究證明缺血再灌注后NO的產生可上調自噬相關蛋白表達，抑制NO產生可降低自噬相關蛋白的表達量，產生腦保護作用。以上研究為進一步深入探討氧化應激和自噬在腦缺血損傷過程中的相互作用關系提供了一定的科學依據，但是作為腦損傷過程中的重要因素，氧化應激與自噬錯綜復雜的關系仍需要進行更深層次的探究。

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