小兒主動脈縮窄圍術(shù)期泛素羧基末端水解酶L1的變化與臨床意義

童 峰 李 磊 趙 濤 李曉峰 劉迎龍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院心外科，北京 100056；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院小兒心臟中心， 北京 100029)

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)引起腦損傷可導(dǎo)致住院時間延長、住院費用增加、病死率和其他合并癥增加[1]。監(jiān)測腦損傷標志物有利于嬰幼兒CPB相關(guān)腦損傷的早期診斷和治療。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)，膠質(zhì)蛋白S-100β和髓鞘堿性蛋白等腦損傷標志物由于敏感度和/或特異性不高，使其臨床應(yīng)用仍受限[2]。泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal esterase-L1,UCH-L1)在神經(jīng)元中表達豐富，是泛素蛋白酶體系統(tǒng)中一種重要的去泛素化酶，對維持神經(jīng)軸突功能的穩(wěn)定起重要作用[3]。本研究關(guān)注小兒主動脈縮窄圍術(shù)期血清UCH-L1變化特點，初步評估UCH-L1在小兒中度低溫停循環(huán)(moderate hypothermia circulatory arrest，MHCA)/選擇性腦灌注(selective cerebral perfusion，SCP)相關(guān)的腦損傷中是否是一種有效的血清標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入標準：診斷為單純主動脈縮窄(aortic coarctation，CoA)或合并心內(nèi)畸形的CoA患兒，并同意參與研究。排除標準：年齡>6歲，生后Apgar評分<7分，術(shù)前有明顯神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)，術(shù)前左室射血分數(shù)<35%，染色體異常，二次手術(shù)，術(shù)前腎功能不全。根據(jù)納入和排除標準，在2012年1月-2013年6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院小兒心臟中心住院手術(shù)的患兒共43例。其中4例血液樣本顯示明顯異?；蛉苎仨殎G棄，最終共納入39例。將研究對象分為2組：A組為單發(fā)主動脈縮窄的患者，未行CPB；B組包括合并室間隔缺損或其他心內(nèi)畸形的主動脈縮窄患者，需要進行中度低溫停循環(huán)聯(lián)合SCP操作。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準并獲得所有參與者父母的同意。

1.2 麻醉、灌注技術(shù)

所有患兒采取相同的麻醉管理策略。B組患兒CPB平均灌注壓維持在40～60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；在主動脈阻斷后，鼻咽溫降至23～26 ℃，直腸溫降至24～28 ℃行SCP，調(diào)整動脈灌注流量為20～30 mL·kg-1·min-1,SCP期間嚴格按照安貞醫(yī)院常規(guī)操作[4]。手術(shù)期間不應(yīng)用負壓吸引而采用節(jié)血過濾裝置，手術(shù)結(jié)束后不進行自體輸血。

1.3 手術(shù)操作

兩組均采取標準的外科操作技術(shù)：所有患兒的手術(shù)通過典型的左胸后外側(cè)切口或胸部正中切口進行，根據(jù)主動脈弓形態(tài)決定主動脈弓和降主動脈吻合方法[5]。

1.4 監(jiān)護與數(shù)據(jù)采集

患兒麻醉誘導(dǎo)后將近紅外光譜探頭(Niro200; Hamamatsu Photonics公司,日本)置放在患兒的雙側(cè)前額處記錄腦組織氧飽和度(brain tissue oxygen saturation，ScO2)，B組在手術(shù)中的6個不同時點記錄，A組僅記錄t1和t6時點ScO2值(t1: 麻醉誘導(dǎo)后,t2: CPB后5 min, t3:SCP后5 min,t4: SCP停止后5 min, t5:CPB停止后5 min, t6:外科關(guān)胸)。

在另外6個不同時點(T1:麻醉誘導(dǎo)后，T2：外科關(guān)胸，T3：術(shù)后2 h，T4：術(shù)后8 h，T5：術(shù)后24 h，T6：術(shù)后48 h)，從中心靜脈導(dǎo)管取血并離心(離心半徑13.5 cm，3 000 r/min，15 min)分離血清。使用相應(yīng)商品化試劑盒酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清UCH-L1，S100β和NSE濃度[5]。

術(shù)后患兒被轉(zhuǎn)送到ICU；所有患者在術(shù)后8 h，脫離呼吸機后6 h及出院前進行改良格拉斯哥昏迷評分(James’ adaptation of Glasgow coma scale，JGCS)測定，評估腦損傷的嚴重程度。神經(jīng)系統(tǒng)合并癥被定義術(shù)后新出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀或體征，在出院后30 d內(nèi)或住院期間的死亡定義為早期死亡。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前分組資料

兩組間性別和年齡與術(shù)前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，B組手術(shù)時體質(zhì)量與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中A組合并畸形：主動脈發(fā)育不良1例，主動脈二瓣化畸形1例，卵圓孔未閉1例，動脈導(dǎo)管未閉10例，二尖瓣狹窄2例，氣管狹窄1例；B組合并畸形：主動脈發(fā)育不良3例，主動脈二瓣化畸形5例，室間隔缺損14例，房間隔缺損6例，動脈導(dǎo)管未閉11例，部分心內(nèi)膜墊缺損1例，主動脈瓣下隔膜2例，肺動脈吊帶1例，二尖瓣狹窄1例，腭裂1例，氣管狹窄2例。

A組降主動脈阻斷時間(23.76±5.94)min與B組(34.27±8.74)min比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組CPB和主動脈阻斷時間分別為(137.50±26.99) min，(71.32±12.71) min。B組術(shù)后呼吸機輔助通氣時間和住院時間較A組明顯延長(t=9.403，P=0.034)。兩組患兒術(shù)后均無死亡，詳見表1。

表1 術(shù)前兩組主動脈縮窄患兒臨床資料Tab.1 Clinical data of patients with aorticcoarctation in two groups

groupA: CoA patients without CPB;groupB: CoA patients with SCP combined with intracardiac malformations；CoA:aortic coarctation;SCP:selective cerebral perfusion.

2.2 兩組ScO2濃度變化

兩組間麻醉誘導(dǎo)后ScO2差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.939)。B組ScO2在CPB開始后有增加，并在降溫期間保持在同一較高水平，在復(fù)溫階段ScO2逐漸下降到最低點。另一方面，A組患者在整個手術(shù)操作過程ScO2沒有顯著的變化 (圖 1)。

圖1 兩組不同時點ScO2變化

ScO2：cerebral tissue oxygen saturation；t1:induction of anesthesia;t2: 5 min after cardiopulmonary bypass;t3: 5 min after selective cerebral perfusion;t4: 5 min after selective cerebral perfusion;t5: 5 min after stopping cardiopulmonary bypass;t6: surgical closure.

2.3 兩組血清UCH-L1，S-100β和NSE的濃度變化

麻醉誘導(dǎo)后2組患者血清生物化學(xué)指標間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。A組術(shù)前、術(shù)后不同時點的血清S100β濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.003,P=0.690)，而術(shù)后2 h的血清NSE濃度和術(shù)后2 h,8 h血清UCH-L1濃度較術(shù)前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B組術(shù)后UCH-L1，S-100β蛋白和NSE濃度較術(shù)前顯著增加(P<0.01)；NSE和S100β蛋白血清濃度峰值在術(shù)后2 h，而UCH-L1血清峰值濃度出現(xiàn)在術(shù)后8 h。在B組中血清UCH-L1蛋白水平從基線時間到手術(shù)后8 h持續(xù)增加，但術(shù)后24 h即基本恢復(fù)基線水平，術(shù)后24 h兩組間UCH-L1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.841,P=0.791；F組間=8.9，P組間=0.005)(圖2)。兩組間比較，B組術(shù)后S100β蛋白有顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.355,P=0.003)；B組S100β蛋白水平自術(shù)后2 h下降，至術(shù)后48 h恢復(fù)至基線水平，術(shù)后24 h兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.416,P=0.750；F組間=17.4，P組間<0.001) (圖3)。B組NSE水平術(shù)后波動較大，且術(shù)后48 h均值低于A組水平(F組間=1.153，P組間=0.29)(圖4)。

圖2 不同檢測時點血清UCH-L1濃度變化Fig.2 Changes in serum UCH-L1 concentration atdifferent points

*P<0.05vsgroup A；UCH-L1：ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1；T1: induction of anesthesia；T2：surgical closure；T3：2 h after the operation；T4：8 h after the operation；T5：24 h after the operation；T6：48 h after the operation.

2.4 2組血清UCH-L1和S-100β蛋白與CPB時間相關(guān)性分析

B組中UCH-L1和血清S-100β蛋白的峰值水平與CPB時間長短相關(guān)(r=0.575，P=0.005),(r=0.453，P=0.034)，與降主動脈阻斷時間不相關(guān)。

2.5 2組患兒JGCS評分及預(yù)后

兩組術(shù)前JGCS評分均為15分，術(shù)后8 h JGCS A組為(14.06±0.83)分，B組為(13.82±1.18)分，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；其中在B組中4例患者JGCS評分<12分，而在A組中沒有患者的得分低于12分。在患者脫離呼吸機后6 h， 2組JGCS評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.205)，出院前評分均達到15分。所有患者未出現(xiàn)抽搐，偏癱等嚴重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，而B組中3例患者術(shù)后發(fā)生譫妄狀態(tài)，所有患者未遺留不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。

圖3 不同檢測時點血清S100-β濃度變化Fig.3 Changes in serum S100-β concentration atdifferent detection points

*P<0.05vsgroup A；T1: induction of anesthesia；T2：surgical closure；T3：2 h after the operation；T4：8 h after the operation；T5：24 h after the operation；T6：48 h after the operation.

圖4 不同檢測時點血清NSE濃度變化Fig.4 Changes in serum NSE concentration at different points

*P<0.05vsgroup A;NSE：neuron specific enolase；T1: induction of anesthesia；T2：surgical closure；T3：2 h after the operation；T4：8 h after the operation；T5：24 h after the operation；T6：48 h after the operation.

3 討論

CPB造成的腦組織損傷與CPB的低灌注狀態(tài)、全身炎性反應(yīng)、腦血管栓塞、缺血/再灌注損傷, 代謝物積聚及興奮性氨基酸(excitatory amino acids,EAA)增加等因素有關(guān)[6]。而小兒神經(jīng)細胞的樹突和軸突少而短，更易受缺血、缺氧等影響而發(fā)生不可逆性凋亡壞死，所以先天性心臟病術(shù)后如注意力，行為問題、學(xué)習(xí)困難、高級整合功能障礙等仍然常見[7]。心臟手術(shù)患兒術(shù)中及術(shù)后早期大多處于全身麻醉或鎮(zhèn)靜狀態(tài)，且需呼吸、循環(huán)支持，常規(guī)影像學(xué)檢查如頭部CT等往往難以實現(xiàn)，使得CPB相關(guān)腦損傷的早期診斷很困難。從受損的腦組織中釋放的生物標志物在腦脊液中的監(jiān)測較準確，干擾因素少，但臨床獲取標本較困難,而血清相對容易獲取。監(jiān)測血清中S-100β蛋白，髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)，NSE等臨床應(yīng)用較多，但易受多種因素干擾，致其特異度和/或敏感度有限。

相關(guān)研究[5，8]發(fā)現(xiàn)腦損傷后UCH-L1可大量釋放到外周血或腦脊液中，腦脊液中UCH-L1升高與腦缺血再灌注損傷相關(guān)，同時其升高的水平可反映顱腦損傷后血腦屏障損傷程度。Arnaoutakis等[9]在CPB動物模型中發(fā)現(xiàn)深低溫停循環(huán)(deep hypothermia circulatory arrest,DHCA)后血清中UCH-L1明顯升高，升高幅度與DHCA時間相關(guān)，術(shù)后8 h風(fēng)險預(yù)測臨界值為3.9 ng/mg。而血清UCH-L1水平與SCP后腦損傷的關(guān)系，以及和其他常用指標的相關(guān)性研究仍鮮有報道。本研究分析了血清UCH-L1水平與多種臨床因素(包括CPB時間，術(shù)中腦氧飽和度等)和其他腦損傷生物標志物間的關(guān)系。結(jié)果表明，術(shù)后血清UCH-L1水平在B組患者明顯高于A組，其變化趨勢與常用腦損傷生物標志物有趨同性；并且其升高幅度和CPB時間等呈正相關(guān)。B組血清 UCH-L1水平升高可能是在CPB過程中神經(jīng)細胞損傷和腦毛細血管通透性增加使其釋放到外周血液。這種變化與CPB手術(shù)圍術(shù)期諸多腦損傷因素有關(guān)[10]。A組中血清UCH-L1和S-100β水平始終保持在術(shù)前正常范圍，僅血清NSE濃度與術(shù)前相比有顯著升高。這樣的研究結(jié)果表明，非CPB手術(shù)是一種更符合生理而且創(chuàng)傷小的過程，符合臨床實際。而與A組患者相比， B組患者UCH-L1的升高則反映了長時間的CPB可引起腦損傷；同時在B組中手術(shù)后各種血清標志物濃度隨著時間變化的過程是不同于A組的。這些變化可能基于腦部的解剖基礎(chǔ)。膠質(zhì)細胞終足與毛細血管內(nèi)皮緊密相連參與血-腦脊液屏障的組成，腦組織受到缺血、缺氧打擊后，血-腦脊液屏障破壞，此時星形膠質(zhì)細胞中的S100β釋放入血。同時膠質(zhì)細胞作為神經(jīng)元與血管之間代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運站，使存在于神經(jīng)元細胞中的UCH-L1和NSE需經(jīng)過它釋放入血。本研究結(jié)果中B組血清UCH-L1峰值濃度出現(xiàn)在術(shù)后8 h，而為NSE和S100β血清峰值濃度出現(xiàn)在術(shù)后2 h。NSE的血清峰值濃度較UCH-L1提前出現(xiàn)考慮可能與外源性污染有關(guān)。

目前研究[11-13]已表明血清S-100β和NSE水平的升高可以由外源性污染引起。為減少其他來源的S-100β蛋白污染，本研究在手術(shù)中不用心內(nèi)吸引而采用血液回收過濾系統(tǒng)，以減少對檢測結(jié)果的干擾。CPB不可避免引起一定程度的溶血，為了減少溶血對研究結(jié)果的影響，所有患者均未進行自體輸血，術(shù)后出現(xiàn)明顯溶血時也被排除在研究之外。雖然UCH-L1在卵巢，睪丸和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中可以檢測到，但其在大腦中的含量更豐富，且特異性更高[3]；同時大腦較其他器官對缺血、缺氧的耐受力差，所以心臟手術(shù)后早期血清UCH-L1濃度的升高更可能是由腦組織損傷引起的[14-15]。

在這項研究中手術(shù)后血清UCH-L1水平和術(shù)后神經(jīng)功能評分之間的相關(guān)性不大，考慮與研究樣本較小和GCS對輕度腦損傷的診斷效率有關(guān)。由于時間和研究條件限制沒有進行中遠期神經(jīng)認知功能評估，但進一步完善相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)檢查很有必要。綜上所述，在本研究中小兒主動脈縮窄患者行MHCA/SCP后可出現(xiàn)血清UCH-L1濃度的升高，其與S100β，NSE等的變化有一定的趨同性，其可能成為一具更好特異性敏感性的腦損傷血清標志物。

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