CTLA-4與CD28在FⅧ抑制物陽性的血友病A患兒中的表達分析

李 楊 陳振萍 李 剛 甄英姿 吳心怡 吳潤暉

(首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心，北京 100045)

血友病A(hemophilia A, HA)是由于缺乏FⅧ導致的先天性出血性疾病，最主要的臨床表現(xiàn)為自發(fā)性、難以控制的出血。凝血因子抑制物是在血友病替代治療過程中產(chǎn)生的針對凝血因子的特異性抗體，是目前血友病治療中最嚴重的合并癥之一。重型血友病A患者抑制物發(fā)生率高達20%～30%，兒童是抑制物產(chǎn)生的高危人群；血友病B患者抑制物發(fā)生率<5%[1]。抑制物能特異性的中和外源性輸注的凝血因子，不僅增加了出血的風險，而且使得替代治療效果降低或無效。目前對于抑制物的產(chǎn)生沒有預防性耐受治療方法，對于抑制物陽性患者，尤其是有嚴重出血的患者，建議盡早開始進行免疫誘導耐受治療(immune tolerance induce,ITI)。雖然免疫耐受治療以及免疫抑制劑的治療方案取得了一定的治療成效，但是對于相關(guān)的免疫機制仍不清楚。對于抑制物產(chǎn)生及消除的過程中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)狀態(tài)的研究十分重要。

FⅧ抑制物的產(chǎn)生主要依賴Th細胞功能，抗原提呈細胞和B淋巴細胞共同作用[2]。T細胞上的CTLA-4/CD28是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的協(xié)同刺激分子之一，它們競爭性地與抗原提呈細胞上的B7分子結(jié)合，在調(diào)控和維持機體免疫狀態(tài)的平衡中發(fā)揮重要作用。CD28分子表達在T細胞表面，激活和維持T細胞功能，CD28結(jié)合B7分子，產(chǎn)生激活T細胞的第二信號，刺激機體產(chǎn)生免疫應答。細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)，又稱CD152，表達在包括調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Tregs)以及其他被激活的T細胞[3]，與CD28分子競爭性結(jié)合B7分子，是體內(nèi)重要的免疫負調(diào)控因子。CTLA-4與B7分子有很強的結(jié)合力，能夠改變正常的T細胞激活，抑制了適當?shù)拿庖叻磻?，促進腫瘤細胞的存活[4]，作為重要的免疫調(diào)控因子，其在自身免疫性疾病、腫瘤及移植免疫中發(fā)揮重要作用。

目前對于血友病抑制物產(chǎn)生的免疫機制仍不清楚，導致抑制物的預防和治療目前均無可靠全面的理論依據(jù)，本研究探討在Th細胞上CTLA-4/CD28軸的平衡對血友病A兒童抑制物的作用，為進一步探索血友病A兒童FⅧ抑制物產(chǎn)生及消除過程中的免疫機制提供基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集自2016年12月1日至2018年1月1日于首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院血友病專業(yè)門診進行治療的血友病A患兒，入組標準為：1)年齡<18歲，男性；2)均已經(jīng)確診為中重型血友病A患兒，F(xiàn)Ⅷ∶C活性≤2%；3)在首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心血檢室連續(xù)兩次檢測血友病FⅧ抑制物為陽性(抑制物滴度≥0.6 BU/mL)或陰性(抑制物滴度<0.6 BU/mL)，抑制物陰性患兒暴露日(exposure day, ED)均超過50 d。排除標準為：1)血友病A患兒，F(xiàn)Ⅷ∶C活性>2%；2)血友病B患兒；3)血友病FⅧ抑制物陰性患兒暴露日小于50天；4)伴有骨關(guān)節(jié)炎、風濕及類風濕關(guān)節(jié)病、銀屑病、混合性結(jié)締組織病等自身免疫系統(tǒng)疾病。

本研究內(nèi)容征得入組患兒監(jiān)護人的知情同意，研究方案獲得首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 FⅧ抑制物檢測[5-6]

FⅧ抑制物滴度檢測應用改良Nijmegen法。檢測前經(jīng)過72 h洗脫期，連續(xù)2次檢測滴度≥0.6 BU/mL定義為抑制物陽性，<0.6 BU/mL定義為抑制物陰性。

1.3 CD28+Th細胞檢測

應用流式細胞術(shù)檢測患兒外周血CD28+Th細胞。外周全血中加入流式抗體：anti-CD3-PerCP (BD公司，美國)、anti-CD4-FITC (BD公司，美國)、anti-CD28-PE (Milteny公司，德國)，室溫避光孵育20 min，紅細胞裂解液(BD FACS Lysing Solution，美國)溶解紅細胞10 min，所有樣本設(shè)置對照管，洗滌后上機分析。

1.4 CTLA-4+Th細胞檢測

應用流式細胞術(shù)檢測患兒外周血CTLA-4+Th細胞。外周全血分離單個活細胞，應用植物血凝素(PHA，Sigma Aldrich?, Saint Louis, 美國)10 μg/mL 刺激培養(yǎng)48 h。刺激后細胞加入流式抗體：anti-CD3-PerCP， anti-CD4-FITC，室溫避光孵育20 min，加入破膜固定工作液[FoxP3 Fixation/Permeabilization concentrate體積∶FoxP3 Fixation/Permeabilization Diluent(4 ℃保存)體積=1∶3]避光孵育1 h，洗滌后加入anti-CTLA-4-PE抗體(BD公司，美國)，避光孵育40 min，所有樣本均設(shè)置對照管，洗滌后上機分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 入組情況

共計入組58例患兒，入組患兒均為中重型血友病A(FⅧ∶C活性≤2%)患兒，其中抑制物陽性患兒28例，中位月齡為41(14～158)個月；中位抑制物滴度為18.10(1.00～100.00)BU/mL；抑制物陰性患兒30例，月齡為72(6～199)個月，所有抑制物陰性患兒均超過50個暴露日。

2.2 血友病FⅧ抑制物陽性組與陰性組患兒外周血CTLA-4+Th、CD28+Th細胞的表達情況

抑制物陽性組患兒外周血CD28+Th細胞表達與陰性組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.065)；血友病FⅧ抑制物陽性組患兒外周血的CTLA-4+Th細胞表達百分比低于陰性組患兒(P=0.038)，差異具有統(tǒng)計學意義；血友病FⅧ抑制物陽性組患兒CTLA-4/CD28細胞表達百分比比值低于陰性組(P=0.042)，差異具有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)在Th細胞門下記錄統(tǒng)計，詳見表1、圖1。

表1 抑制物陰性組與陽性組相關(guān)免疫細胞表達Tab.1 Immune cells in inhibitor negative and positive group M(P25，P75)

圖1 抑制物陽性組與陰性組相關(guān)免疫細胞的表達Fig.1 Immune cells in inhibitor negative and positive group

A:There was no difference in the proportion of CD28+Th cells in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group(n=30);B:There was significant difference in the proportion of CTLA-4+Th cells in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group(n=30);C:There was significant difference in the proportion of CTLA-4/CD28 in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group (n=30)*P<0.01;ns:no significance..

2.3 血友病FⅧ抑制物低滴度組和抑制物高滴度組CTLA-4+Th、CD28+Th細胞表達情況

因為FⅧ抑制物滴度的不同會導致抑制物消除治療的效果存在差異。將抑制物陽性組分為低滴度組(滴度<40 BU/mL)和高滴度組(滴度≥40 BU/mL)，比較血友病FⅧ抑制物低滴度組和抑制物高滴度組CTLA-4+Th細胞、CD28+Th細胞在外周血中的比例情況。

低滴度組患兒抑制物滴度為12.30(1.02～35.20)BU/mL，高滴度組滴度為59.20(43.20～100.00)BU/mL。研究結(jié)果顯示，CD28+Th細胞及CTLA-4+Th細胞的表達百分比和CTLA-4/CD28比值在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。詳見表2。

表2 相關(guān)免疫細胞在低滴度和高滴度組的表達Tab.2 Immune cells in low titer inhibitor and high titer inhibitor group M(P25，P75)

3 討論

血友病A是X性染色體連鎖遺傳的出血性疾病，臨床以自發(fā)性出血為主要臨床表現(xiàn)，主要為男性發(fā)病，女性攜帶，發(fā)病率在活產(chǎn)男嬰中為0.5/10 000[7]。目前最為有效的治療方式為外源性凝血因子制劑的替代治療，根據(jù)患者的疾病類型及出血的輕重程度，補充凝血因子。隨著診斷水平的提高、藥品供應的增加以及社會關(guān)注程度的加強，中國血友病A兒童從診斷、治療到康復及護理等多方面的醫(yī)療水平均得到很大程度的提高，極大的改善了中國血友病兒童的生活質(zhì)量，顯著降低了中國血友病A兒童由于關(guān)節(jié)、肌肉出血引起的殘疾，甚至是由于嚴重、大量出血導致的死亡[8]。

目前，替代治療過程中血友病FⅧ抑制物的產(chǎn)生問題成為目前血友病治療中最大的“攔路虎”之一。無論是內(nèi)外源性凝血因子的替代治療還是基因治療，血友病凝血因子抑制物的產(chǎn)生都是挑戰(zhàn)[1]。在不同研究[9-11]中，血友病凝血因子FⅧ抑制物陽性率為5%～30%，而血友病FⅨ抑制物陽性率遠低于FⅧ，目前有研究顯示低于3%。兒童是抑制物發(fā)生的高危人群，同樣也是預防和治療抑制物的重要群體。中國血友病A兒童的抑制物產(chǎn)生率為20%～30%[12-13]。根據(jù)臨床研究及流行病學的分析，血友病A抑制物的產(chǎn)生受到多方面因素的共同影響。首先是遺傳因素，抑制物的產(chǎn)生受到種族、家族史、FⅧ基因突變類型和細胞表面分子的遺傳易感性等影響[10-11,14-16]；同樣，抑制物的形成還受到非遺傳因素的影響，包括治療方案、治療強度、初次治療的年齡、治療使用藥品的類型(重組或血漿源性)，研究[17]表明，強烈的FⅧ暴露，尤其生命早期的嚴重出血、手術(shù)、腫瘤、免疫、炎性反應、感染等事件，也是導致抑制物形成的重要原因。

T細胞的活化過程為免疫性疾病的治療提供了思路和方法，共刺激通路作為T細胞活化的重要方式，其通路上的拮抗劑可以誘導抗原特異性耐受，從而防止自身免疫性疾病和器官移植中排異反應的發(fā)展[18]。T細胞的完全激活需要雙重信號，第一個信號抗原呈遞細胞(antigen presenting cell, APC)上肽-主要組織相容性復合物與T細胞受體連接；第二信號則來源于T細胞表面與APC表面的共刺激分子的相互作用[19]。目前認識較多的共刺激通路分子包括CD28、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)等。

CTLA-4和CD28是表達在CD4+T細胞和CD8+T細胞的同源受體，介導T細胞活化中的相反功能[20]。CD28作為T細胞表面主要的輔助受體分子，其在APC上的配體為B7-1(CD80)、B7-2(CD86)。CD28在確定T細胞活性以及敏感性上發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]，CD28對于控制自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育和體內(nèi)平衡非常重要[21]。而CTLA-4作為重要的負調(diào)控因子，在自身免疫性疾病和移植排異反應中發(fā)揮著顯著的負調(diào)控作用。CTLA-4多表達在Foxp3+T細胞和活化的T細胞內(nèi)，實驗[20]證實，敲除CTLA-4基因的小鼠會發(fā)生自身反應性T細胞釋放導致的致死性自身免疫反應。而CTLA-4/CD28在T細胞表達的平衡是T細胞相關(guān)免疫正常的重要因素。

在本研究結(jié)果中，CTLA-4/CD28比值在血友病A抑制物陽性患兒表達顯著低于抑制物陰性患兒，差異具有統(tǒng)計學意義，說明在血友病A抑制物陽性患兒中存在T細胞免疫功能的異常；然而研究結(jié)果顯示，兩組患兒的CD28+Th細胞表達差異無統(tǒng)計學意義，說明上述平衡軸的差異主要由CTLA-4+Th細胞表達的差異引起，比值與外周血CTLA-4+Th細胞的表達百分比具有很高的相關(guān)性CTLA-4/CD28軸的失衡與血友病FⅧ抑制物的產(chǎn)生，主要是由于CTLA-4+Th細胞的表達不足。CTLA-4主要發(fā)揮免疫負調(diào)控作用，筆者對血友病A患兒的研究表明，CTLA-4的表達不足，導致機體T細胞相關(guān)的免疫功能在激活后不能得到有效的負向調(diào)控，不能及時有效的壓制激活的T細胞，在T細胞的刺激下，誘導FⅧ抑制物的產(chǎn)生。CTLA-4途徑是機體調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)所必需的途徑，與Treg細胞的負調(diào)控作用是近些年對于免疫負調(diào)控研究的熱點問題，尤其是在腫瘤的免疫性治療、移植排異反應和自身免疫相關(guān)的疾病中[22]。有學者[23]認為，Treg通常是通過CTLA-4發(fā)揮抑制作用，但是CTLA-4也可以在非Treg中發(fā)揮作用， Foxp3和CTLA-4可直接指導獨立的免疫調(diào)節(jié)途經(jīng)，實際上在很大程度上重疊，這些想法有望幫助我們更好地了解這些途徑的潛在生物學和治療意義。

CD28主要表達在CD4+T和CD8+T細胞，發(fā)揮激活T細胞的功能。CTLA-4表達在激活的T細胞，主要發(fā)揮免疫抑制作用。CD28與CTLA-4與抗原呈遞細胞上的CD80和CD86結(jié)合，人類CD28和CTLA-4也可以與ICOS(inducible costimulatory molecale)配體結(jié)合[3]。Wiest等[4]在特異性哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘嚴重程度與CD4+CTLA-4+T細胞的表達成反比，即CD4+CTLA-4+T細胞表達越低，哮喘越嚴重。CTLA-4沒有起到足夠的負調(diào)控功能，不能控制導致炎性反應。

結(jié)論：CTLA-4/CD28軸在維持機體免疫穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在血友病FⅧ抑制物陽性患兒，CTLA-4/CD28軸的平衡情況與陰性組存在差異，其細胞表達比值顯著低于抑制物陰性組，并且主要是由于CTLA-4+Th細胞的低表達引起。研究結(jié)果表明，CTLA-4可能是血友病FⅧ抑制物產(chǎn)生的免疫影響因素之一。

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