針刺留針與否對血管性癡呆大鼠認知功能及皮層神經(jīng)元損傷的影響

李天然 葉陽 楊靜雯 肖凌勇 王雪蕊 閆超群 邵佳凱 劉存志

摘要：目的 觀察留針與不留針情況下針刺“百會”配伍“足三里”對血管性癡呆（VD）大鼠認知功能及大腦皮層神經(jīng)元損傷的影響，探討留針與否的針刺效應(yīng)。方法 采用永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎方法建立VD大鼠模型。實驗大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、留針組、不留針組，每組8只。針刺模型大鼠“百會”+“足三里”后，Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色檢測大鼠大腦皮層神經(jīng)元損傷。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低，皮層神經(jīng)元損傷明顯；與模型組比較，留針組、不留針組空間學(xué)習(xí)記憶能力均顯著提高，皮層神經(jīng)元損傷改善；其中，留針組空間學(xué)習(xí)記憶能力提高更多，皮層神經(jīng)元損傷改善更明顯。結(jié)論 針刺可改善VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和皮層神經(jīng)元損傷，留針效果更好。

關(guān)鍵詞：血管性癡呆；針刺效應(yīng)；留針；認知功能；皮層神經(jīng)元；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.014

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0061-05

Effects of Acupuncture Needle Retaining or Not on Cognitive Function and

Cortical Neurons in Rats with Vascular Dementia

LI Tian-ran1，2， YE Yang2， YANG Jing-wen2， XIAO Ling-yong2，

WANG Xue-rui2，3， YAN Chao-qun2， SHAO Jia-kai2， LIU Cun-zhi4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2. Acupuncture Center Affiliated to Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China； 3. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China； 4. Dongfang Hospital， Beijing University of

Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To compare the effects of acupuncture needle retaining or not in “Baihui” compatibility “Zusanli” on cognitive function and cortical neurons in rats with vascular dementia （VD）； To discuss the acupuncture effects of acupuncture needle retaining or not. Methods VD model was established by permanent bilateral common carotid arteries occlusion. The experimental rats were randomly divided into sham-operation group， model group， needle retaining group， without needle retaining group， with 8 rats in each group. The acupoints “Baihui” and “Zusanli” were used. Morris water maze test was employed to detect the abilities of spatial learning and memory in rats. Nissls staining and immunofluorescence technique were used to observe the status of cortical neurons. Results Compared with sham-operation group， the abilities of spatial learning and memory decreased significantly and the injuries of cortical neurons were severe. Compared with model group， the abilities of spatial learning and memory in needle retaining group and without needle retaining group increased significantly and the injuries of cortical neurons were improved， among which， the abilities of spatial learning and memory was increased more， and the injuries of cortical neurons were better improved in the needle retaining group. Conclusion Acupuncture can improve the abilities of spatial learning and memory and cognitive function， and acupuncture needle retaining has better effects.

Keywords： vascular dementia； acupuncture effects； needle retaining； cognitive function； cortical neurons； rats

基金項目：北京市教育委員會科技計劃重點項目（KZ201710025025）

通訊作者：劉存志，E-mail：lcz623780@126.com

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指以缺血缺氧性或出血性腦損傷造成的記憶、認知及行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征。我國65歲以上老年人VD患病率為1.2%～4.2%，70歲以上老年人年發(fā)病率為每千人6～12例[1]。與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的腦內(nèi)結(jié)構(gòu)主要是大腦皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)、海馬及其鄰近結(jié)構(gòu)。其中，大腦皮層特別是額葉、顳葉是遠事記憶信息轉(zhuǎn)變、貯存的主要部位[2]。在慢性腦血流灌注不足時，模型大鼠大腦皮質(zhì)中出現(xiàn)大量神經(jīng)元凋亡[3-4]。

本課題組前期研究表明，針刺可改善VD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，該作用可能是通過減輕氧化應(yīng)激[5-6]、神經(jīng)元凋亡[7]、神經(jīng)炎癥等機制實現(xiàn)的。在針刺治療疾病的過程中，留針與否尚存在一定爭議[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺“百會”“足三里”能有效改善慢性腦低灌注引起的大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能損害。本研究擬通過行為學(xué)和病理學(xué)方法，觀察留針與否對VD大鼠認知功能和皮層神經(jīng)元損傷的影響，以期為臨床上針刺治療VD是否留針提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級SD雄性大鼠32只，4月齡，體質(zhì)量270～300 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級動物房。所有動物實驗均滿足動物倫理委員會的要求。根據(jù)隨機數(shù)字表將動物分為假手術(shù)組、模型組、留針組、不留針組，每組8只。

1.2 主要試劑和儀器

戊巴比妥鈉（P3761，Sigma），多聚甲醛（廣州晶欣生物科技有限公司），乙醇（北京化工廠），碘伏（青島海諾生物工程有限公司），中性樹脂（國藥集團化學(xué)試劑股份有限公司），Morris水迷宮系統(tǒng)（美國CSI公司），冰凍切片機（德國Leica公司），焦油紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)公司），DHG-9023A烤箱（上海林頻儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus），華佗牌0.25 mm×13 mm一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 造模

大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉。頸正中切開皮膚，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，分離雙側(cè)頸總動脈，采用5-0絲線將雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎。切口處滴少許慶大霉素，防止感染。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外其他操作同手術(shù)組。大鼠術(shù)后死亡率為30%。

1.4 Morris水迷宮實驗

水迷宮水池直徑160 cm，高40 cm，水深30 cm。池壁上4個等距離點將水池分為4個象限，將平臺置于東北象限。末次針刺后第2日開始水迷宮試驗。水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。將大鼠背對水池隨機從4個不同象限放入水中，記錄朝向角（動物開始游泳的方向與“入水點-平臺”連線所成的夾角）和逃避潛伏期。如果90 s內(nèi)找不到平臺（潛伏期記為90 s），則由操作者幫助其上平臺，停留30 s，連續(xù)訓(xùn)練5 d。空間探索實驗反映大鼠的記憶能力。在實驗第6日撤除平臺，選任意相同入水點將大鼠放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠在池中的游泳軌跡和時間及和90 s內(nèi)跨越原平臺象限次數(shù)。

1.5 尼氏染色

末次針刺后第2日大鼠灌注，并將腦組織置于4%多聚甲醛液中4 ℃恒溫過夜進行后固定。35%蔗糖溶液浸泡脫水1周，OCT冰凍包埋劑包埋，冠狀位連續(xù)10 μm厚度冰凍切片。將腦片貼于預(yù)先明膠處理過的載玻片上，在焦油紫工作液中孵育45 min，用蒸餾水洗去浮色后入特殊分色液，100%乙醇脫水，二甲苯常規(guī)脫水后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，尼氏體為嗜堿性斑塊或細顆粒。在每張載玻片的大腦皮層額葉區(qū)分別隨機選取5個視野，觀察皮層尼氏染色結(jié)果并拍照分析。

1.6 免疫熒光

將切片準備好后加入NeuN（Abcam）一抗進行孵育（1∶400，4 ℃冰箱過夜），再加入羊抗兔IgG二抗孵育（1∶400，紅色，37 ℃避光60 min），洗滌樣品，封片。BX53型熒光顯微鏡下拍照，觀察大鼠皮層神經(jīng)元的損傷情況。

1.7 干預(yù)

留針組和不留針組取穴均參照動物穴位圖譜[10]取“百會”“足三里”，行捻轉(zhuǎn)補法（捻轉(zhuǎn)角度<180°，頻率>60次/min）。留針組行針30 s，留針20 min，不留針組行針30 s，不留針。2組均每日1次，治療6 d后休息1 d，連續(xù)2周，共治療12次。假手術(shù)組和模型組由同一實驗員進行與針刺組相同時間、相同程度的捉抓刺激。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用重復(fù)測量方差分析比較各組逃避潛伏期；其他數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠朝向角明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各針刺組朝向角均明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），留針組朝向角較不留針組更小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，針刺組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），留針組逃避潛伏期較不留針組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，各針刺組穿越平臺次數(shù)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），留針組穿越平臺次數(shù)較不留針組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；

與不留針組比較，▲P<0.05

圖1 各組大鼠水迷宮實驗朝向角比較（—x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；

與不留針組比較，▲P<0.05

圖2 各組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期比較（—x±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；

與不留針組比較，▲P<0.05

圖3 各組大鼠水迷宮實驗穿越平臺次數(shù)比較（—x±s）

2.2 尼氏染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元排列整齊、緊湊，無明顯尼氏體破裂的現(xiàn)象；模型組大鼠皮層神經(jīng)元排列散亂，細胞帶出現(xiàn)斷裂，神經(jīng)元出現(xiàn)尼氏體碎裂、細胞調(diào)亡；各針刺組大鼠皮層神經(jīng)元排列尚整齊，但細胞間隙增寬，細胞帶較薄，少量神經(jīng)元可見尼氏體碎裂、胞質(zhì)中央尼氏小體消失，留針組大鼠皮層神經(jīng)元較不留針組排列更為整齊、緊湊，少見明顯尼氏體破裂的現(xiàn)象。見圖4。

2.3 免疫熒光結(jié)果

假手術(shù)組大鼠皮層神經(jīng)元數(shù)量較多，排列規(guī)則；模型組神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，細胞排列散亂；各針刺組神經(jīng)元形態(tài)改善，數(shù)量顯著增多，留針組較不留針組皮層神經(jīng)元數(shù)量更多，排列更為規(guī)則。見圖4。

圖4 各組大鼠皮層神經(jīng)元損傷情況（×400）

3 討論

Morris水迷宮實驗在神經(jīng)科學(xué)研究中廣泛用于評價空間學(xué)習(xí)和記憶能力[11-12]。逃避潛伏期是該實驗應(yīng)用最多的指標之一，但其缺點是易受動物游泳能力的影響。朝向角越小說明空間學(xué)習(xí)記憶能力越好。與逃避潛伏期相比，朝向角不僅能更好地消除速度的影響，而且更具有敏感性[13-14]，因此，本研究選用該指標作為水迷宮的主要結(jié)局指標之一。大腦皮層在學(xué)習(xí)和記憶等高級神經(jīng)活動中起著重要作用，慢性低灌注腦血流下降導(dǎo)致該區(qū)域神經(jīng)元慢性進行性變性、脫失。慢性低灌注后，部分皮質(zhì)纖維明顯疏松，少突膠質(zhì)細胞及其髓鞘結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷，是慢性低灌注后實驗大鼠認知行為和神經(jīng)電生理功能減退的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)[15]。尼氏體是神經(jīng)元受損的細胞標志性特征結(jié)構(gòu)之一，慢性腦血流灌注不足時大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元發(fā)生退行性變，尼氏體的結(jié)構(gòu)也被破壞[16]。隨著腦血流的恢復(fù)，皮質(zhì)區(qū)尼氏體逐漸得到修復(fù)，神經(jīng)元的數(shù)量和功能有所恢復(fù)，表明在慢性腦缺血早期皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元損傷可逆[17]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，針刺可顯著緩解VD大鼠海馬和大腦皮層的神經(jīng)元凋亡情況，進而改善VD大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[18-19]。

針刺治療中有效刺激量是影響針刺臨床療效的重要因素。針刺的有效刺激量受多種因素影響，如針刺捻轉(zhuǎn)角度和頻率、針刺間隔時間、是否留針等，其中是否留針是影響針刺刺激量的關(guān)鍵因素之一。留針，是指將針刺入腧穴，行針得氣并施以補瀉手法后，將針留置腧穴內(nèi)一段時間。留針目的是加強針刺的作用和便于繼續(xù)行針施術(shù)，留針時間一般為20～30 min。臨床上針刺治療疾病多以留針為主，但也有研究認為不留針的效果不劣于留針，甚至推薦某些疾病應(yīng)該不留針。高峰等[20]觀察針刺淺刺留針與否治療急性期周圍性面癱的療效差異，發(fā)現(xiàn)周圍性面癱急性期淺刺是否留針，對此病預(yù)后無明顯影響。冷軍[21]研究也認為針刺留針與不留針均可促進新生大鼠腦缺血缺氧后神經(jīng)干細胞的增殖和分化，促進神經(jīng)細胞修復(fù)，減輕功能缺損程度。董梅[9]觀察留針與不留針分別對頸性眩暈患者椎基底動脈系統(tǒng)血流動力學(xué)即時效應(yīng)的影響，結(jié)果顯示針刺留針與不留針均可明顯改善椎基底動脈血流速度，且二者無顯著差異，提示臨床可以不留針代替留針。留針是針刺的重要環(huán)節(jié)，但對于是否需要留針，還需要辨證對待，不可機械應(yīng)用。目前，對于針刺治療VD是否應(yīng)該留針，以及針刺留針與否的效果差異尚缺乏相關(guān)研究。

本實驗結(jié)果表明，針刺組均可改善VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，但留針的效果優(yōu)于不留針。而且，尼氏染色和免疫熒光的實驗結(jié)果同樣顯示，留針組對皮層神經(jīng)元凋亡的改善作用明顯優(yōu)于不留針組。與本研究結(jié)果相似，有研究認為針刺留針的效果優(yōu)于不留針。羅麗平等[22]探討針刺留針與不留針對健康人心臟自主神經(jīng)的生理調(diào)節(jié)作用的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針刺留針和不留針均可減慢心率，但留針減慢心率的作用時間長于不留針。

一般而言，是否留針及留針時間長短主要據(jù)疾病的病情、性質(zhì)而定?！鹅`樞·邪氣藏府病形》曰：“刺急者，深內(nèi)而久留之；刺緩者，淺內(nèi)而疾發(fā)針……”，《靈樞·經(jīng)脈》有“熱則疾之，寒則留之”；其次，應(yīng)按時節(jié)選擇是否留針。《子午流注針經(jīng)》云：“應(yīng)冬春者，宜留針待氣至；應(yīng)秋夏者，呼吸數(shù)畢便宜去針?！爆F(xiàn)代研究認為，針刺的臨床效應(yīng)取決于有效的刺激量和機體的反應(yīng)，而有效的刺激量由刺激強度和持續(xù)時間構(gòu)成。針刺留針可能會通過延長持續(xù)時間積累刺激量，從而增強臨床療效，效果因而優(yōu)于不留針[23]。

綜上，針刺治療是否留針應(yīng)根據(jù)疾病情況、患者體質(zhì)、經(jīng)脈腧穴及病程長短等因素而定。在一定的刺激強度下，是否留針直接影響針刺療效。本課題研究發(fā)現(xiàn)，針刺留針與不留針均可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和皮層神經(jīng)元凋亡，且留針效果優(yōu)于不留針，可為臨床留針與否提供借鑒。

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