青稞酒曲微生物多樣性分析及米根霉制曲條件優(yōu)化

袁亦舟，張偉國(guó)，徐建中

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

青稞酒是西藏地區(qū)的特色飲品，因西藏所具有的特殊地理因素和人文因素賦予了青稞酒獨(dú)特的口感[1]。曲為酒之骨，曲菌的繁殖和產(chǎn)酶將淀粉、蛋白質(zhì)等分解，產(chǎn)生葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)酸、高級(jí)醇等風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)酒的品質(zhì)和出酒率都有極大的影響[2]。對(duì)酒曲中的微生物進(jìn)行分析，對(duì)于篩選功能微生物，實(shí)現(xiàn)青稞酒的工業(yè)化生產(chǎn)有重要的意義。

最初研究酒曲中微生物的方法是傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)法。然而，酒曲中除了可培養(yǎng)的微生物之外，還存在著大量實(shí)驗(yàn)室無(wú)法培養(yǎng)的微生物，單純依靠分離培養(yǎng)法不能反映出酒曲中真實(shí)的微生物菌群。近年來(lái)分子生物技術(shù)成為研究微生物多樣性的新的工具，但傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)法仍然是分離獲得優(yōu)勢(shì)菌種的重要方法[3]。雖然克隆文庫(kù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)推動(dòng)了微生物生態(tài)學(xué)的研究，但有其局限性，如檢測(cè)線低、工作量大等[4-5]。新一代的高通量測(cè)序技術(shù)可以直接測(cè)序復(fù)雜環(huán)境總DNA的PCR產(chǎn)物，該方法擁有成本低、通量高、準(zhǔn)確性高、可以雙向測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，可以快速簡(jiǎn)便地分析復(fù)雜環(huán)境中的微生物組成[6-8]。由于酒曲中存在大量不可培養(yǎng)的微生物，而高通量測(cè)序技術(shù)規(guī)避了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)這一步驟，直接提取酒曲中的總DNA進(jìn)行分析，故相比實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)法更能體現(xiàn)出微生物的多樣性，同時(shí)直接對(duì)DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，與克隆文庫(kù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳法相比減少了實(shí)驗(yàn)步驟，數(shù)據(jù)覆蓋面更大，因此高通量測(cè)序技術(shù)能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[9]。

傳統(tǒng)制曲工藝中自然培養(yǎng)的方法導(dǎo)致曲中微生物群落復(fù)雜，同時(shí)制曲條件不易控制，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,故多采用純種曲的方法，例如，黃酒生產(chǎn)工藝采用米曲霉蘇-16制備熟麥曲[10]，醬油制曲使用米曲霉滬釀3.042菌種[11]，均實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。分離酒曲中的優(yōu)質(zhì)菌株，嚴(yán)格控制條件制作的純種曲的質(zhì)量更為穩(wěn)定，并且與傳統(tǒng)曲相比具有更高的糖化力和液化力[10， 12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序手段探究青稞酒酒曲中微生物群落，同時(shí)分離出在發(fā)酵中起主要作用的菌株制取純種曲來(lái)提高酒曲的糖化力和液化力，為青稞酒的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

青稞及酒曲：購(gòu)自西藏圣禾生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

溶菌酶、溶壁酶、蛋白酶K，TIANGEN公司;E.Z.N.A.Soil DNA Kit、玻璃珠，Sigma公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒，Life公司；TaqDNA Polymerase，Thermo公司；Agencourt AMPure XP，Beckman公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，酵母膏 10，蛋白胨 20，瓊脂粉 15。

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用8層紗布過濾，加熱，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加15～20 g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15～20。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP；Q32866 Qubit?2.0熒光計(jì)，Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler PCR儀，BIO-RAD公司；Research plus 0.5-10 μl移液器，Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室平板分離酒曲微生物

稱取酒曲1 g，加入10 mL的無(wú)菌水，充分振蕩混勻，取上清液稀釋，涂布于3種培養(yǎng)基上，在30 ℃的條件下培養(yǎng)。

1.3.2 酒曲中優(yōu)勢(shì)菌株的分離與鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)分離單菌落，提取單菌落基因組后擴(kuò)增ITS1-4區(qū)并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI(National center for Biotechnology Information)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇Nucleotide collection(nr/nt)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，找到序列相似度最高的菌種。

1.3.3 基因組DNA的提取方法

參考閆亮珍[13]等利用物理化學(xué)法提取酒醅中總DNA的方法。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

提取青稞酒曲總DNA，利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。

真菌高通量測(cè)序選用ITS1-2通用引物，細(xì)菌高通量測(cè)序選用16sV3-V4區(qū)通用引物[14]。所得基因片段經(jīng)純化回收后由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。實(shí)驗(yàn)中用到的引物見表1。

表1 本研究使用的引物Table 1 The oligonucleotides used in this study

1.3.5 序列數(shù)據(jù)處理與分析

通過barcode區(qū)分樣品序列，并對(duì)各樣本序列做QC并去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體[15]。

對(duì)OTU(operational taxonomic unit)進(jìn)行聚類分析，將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來(lái)對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(OTU)；在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取每1個(gè)OTU聚類中的代表性序列，選擇豐度最高的序列作為代表性序列，獲取物種在各個(gè)分類水平上的群落結(jié)果，并計(jì)算ACE、Chao、Shannon、Simpson、Coverage等物種多樣性指數(shù)[16]。

1.4 純種曲的工藝優(yōu)化及分析

1.4.1 純種種曲和生產(chǎn)曲的制作工藝[17]

將酒曲中的優(yōu)勢(shì)根霉分離純化，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)至產(chǎn)生較多的孢子；按照工藝流程制作種曲和生產(chǎn)曲(圖1)。

圖1 制曲工藝流程Fig.1 The process of Koji-making

1.4.2 制曲工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

(1)不同原料對(duì)生產(chǎn)曲質(zhì)量的影響

以麩皮與青稞作為原材料制曲，青稞與麩皮用粉碎機(jī)粉碎，過20目篩，分別用青稞、麩皮、青稞與麩皮比例1∶2、青稞與麩皮比例1∶1、青稞與麩皮比例2∶1為原料制曲，測(cè)定糖化力與液化力。

(2)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生產(chǎn)曲質(zhì)量的影響

在培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96 h時(shí)取樣測(cè)定糖化酶和液化酶的活力，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

(3)料水比對(duì)生產(chǎn)曲質(zhì)量的影響

按原料質(zhì)量的30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%的比例拌水，優(yōu)化不同料水比的制曲條件。

(4)溫度對(duì)生產(chǎn)曲質(zhì)量的影響

培養(yǎng)溫度設(shè)定為24、26、28、30、32、34 ℃，優(yōu)化培養(yǎng)溫度。

(5)不同接種量對(duì)生產(chǎn)曲質(zhì)量的影響

接種量設(shè)定為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，確定最佳接種量。

1.4.3 酒曲糖化力和液化力的測(cè)定[18]

糖化酶活力定義為在35 ℃、pH 4.6條件下，1.0 g干曲1 h水解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/g)。

液化酶活力定義為在35 ℃、pH 4.6條件下，1.0 g干曲在1 h液化1 g可溶性淀粉所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U/g)。

液化液與碘液混合呈無(wú)色后為反應(yīng)終點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板分離結(jié)果

利用培養(yǎng)基分離酒曲中的微生物(表2)，獲得4株不同形態(tài)的菌株；根據(jù)菌落特征認(rèn)為獲得2株霉菌，命名為M1、M2，2株酵母菌，命名為S1、S2。

表2 不同培養(yǎng)基分離結(jié)果Table 2 The result of the isolated strains in differentmediums

4種菌株分離純化后提取基因組，利用真菌通用引物ITS1-ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì)(表3)，由結(jié)果可知分離培養(yǎng)法只能獲得較少種類的微生物，不能準(zhǔn)確反映酒曲中的微生物群落。

表3 分離真菌的序列比對(duì)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 3 Identification and statistics of fungal strains

2.2 真菌及細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過barcode區(qū)分樣品序列，并對(duì)各樣本序列做QC，之后去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，得到個(gè)樣本有效數(shù)據(jù)(表4)。最終真菌多樣性分析獲得27 641個(gè)有效序列，細(xì)菌多樣性分析獲得20 868個(gè)有效序列。

表4 各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of samples data

2.2.2 OTU聚類分析

將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來(lái)對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元 (OTU) ，在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取每1個(gè)OTU聚類中的代表性序列。選擇豐度最高的序列作為代表性序列，選取similarity為0.97時(shí)OTU的聚類數(shù)目，已基本覆蓋了測(cè)序的全部結(jié)果，獲得真菌OTU聚類316個(gè)，細(xì)菌OTU聚類1 434個(gè)。

2.2.3 多樣性指數(shù)分析及物種分類學(xué)分析

群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性。Chao、Ace是用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，Shannon、Simpson用來(lái)估算樣品中微生物多樣性指數(shù)，Shannon值越大，Simpson值越小，代表菌落多樣性越高，Coverage代表各樣品文庫(kù)的覆蓋率。由表5可知真菌OTU數(shù)目小于細(xì)菌，物種多樣性低于細(xì)菌；Coverage值說明本次測(cè)序結(jié)果基本可以代表樣品的真實(shí)情況。

表5 多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 5 The result of community richness and community diversity

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，需要對(duì)OTU進(jìn)行物種分類，采用Na?ve Bayesian assignment算法對(duì)每條序列在不同層級(jí)水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值。一般認(rèn)為概率值(即RDP分類閾值)大于0.8時(shí)此分類結(jié)果可信。對(duì)酒曲真菌及細(xì)菌中各物種在屬的分類水平上的相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 真菌屬水平物種分類豐度單樣本柱狀圖Fig.2 Relative abundance of Qu fungi in genus levels

圖3 細(xì)菌屬水平物種分類豐度單樣本柱狀圖Fig.3 Relative abundance of Qu bacteria in genus levels注：屬水平下，樣本物種分類中豐度占比最高的前50個(gè)物種分類的分布情況，并按照總體豐度從大到小排序?？傮w豐度指的是，在所有樣本中物種分類reads num的總值。顯示前50個(gè)物種分類，剩余物種分類合并成other。

從結(jié)果上看，酒曲中真菌的多樣性小于細(xì)菌，同時(shí)優(yōu)勢(shì)菌株相對(duì)集中；根霉屬(Rhizopus)為優(yōu)勢(shì)菌種，相對(duì)豐度為42.0%，曲霉屬(Aspergillus)相對(duì)豐度值為16.4%，線蟲草屬(Ophiocordyceps)相對(duì)豐度值為0.54%，酵母屬(Saccharomyces)相對(duì)豐度值為0.52%，其余測(cè)序結(jié)果相對(duì)豐度值小于0.1%。真菌中優(yōu)勢(shì)菌株為根霉屬和曲霉屬，同時(shí)也有相當(dāng)一部分未知的微生物，說明主要起到糖化作用的菌株為根霉和曲霉。細(xì)菌中庫(kù)克菌屬(Kocuria)相對(duì)豐度值為6.0%；球菌屬(Macrococcus)相對(duì)豐度值為4.3%；芽孢桿菌屬(Bacillus)相對(duì)豐度值為3.9%；微球菌屬(Micrococcus)相對(duì)豐度值為3.7%；金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、短桿菌屬(Brachybacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、厭氧芽胞桿菌(Anoxybacillus)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養(yǎng)食單胞菌(Stenotrophomonas)相對(duì)豐度值相近，在1.1%～1.5%之間，說明不考慮未知細(xì)菌，但從豐度上來(lái)看細(xì)菌菌株分布沒有明顯的優(yōu)勢(shì)菌株，分布廣且種類眾多，說明細(xì)菌在青稞酒的釀造過程可能中主要起到豐富青稞酒風(fēng)味的作用。

由于高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)庫(kù)不完整，故在高通量測(cè)序中對(duì)獲得的OTU數(shù)目超過200的代表性序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表6和表7所示。在NCBI的比對(duì)結(jié)果中，細(xì)菌中的未知菌較多；真菌中米根霉豐度最高，與平板分離結(jié)果相一致，但釀酒酵母豐度較小，OTU數(shù)目為140并可以用平板分離出來(lái)，說明一些菌種即使在酒曲中有較高的豐度也較難用純培養(yǎng)方法分離。

表6 真菌序列NCBI比對(duì)結(jié)果Table 6 Identification and statistics of fungal strainsin NCBI

2.3 酒曲單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 原料比

以青稞粉和麩皮為原料制曲，單純利用麩皮制曲會(huì)導(dǎo)致霉菌生長(zhǎng)不良，麩皮難以保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，單獨(dú)利用青稞粉會(huì)導(dǎo)致加水潤(rùn)料時(shí)青稞粉結(jié)塊，內(nèi)部沒有空氣使得原料利用率低，故將麩皮與青稞粉混合并選取適合的比例，能夠在滿足米根霉生長(zhǎng)需要的同時(shí)提高液化糖化酶活力。由圖4可知在麩皮與青稞的比例是2∶1時(shí)酶活性最高，這是由于再加水潤(rùn)料時(shí)青稞粉形成大小合適的小團(tuán)分布在麩皮之中，合適的比例使得曲的結(jié)構(gòu)蓬松，可以提供充足的氧氣。

表7 細(xì)菌序列NCBI比對(duì)結(jié)果Table 7 Identification and statistics of bacteria strainsin NCBI

圖4 原料比對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of raw material ratio on enzyme activity

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間

制曲的過程是微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的過程，前期主要是米根霉的菌絲生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶量較少，菌體的生長(zhǎng)基本完成后就會(huì)迎來(lái)產(chǎn)酶高峰期，繼續(xù)培養(yǎng)孢子開始著生，反而會(huì)降低酶活力。由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化酶和液化酶的活力也隨之提高，在72 h達(dá)到最高水平，之后隨時(shí)間的增長(zhǎng)曲的酶活力有所降低，故選取72 h為制曲的最佳時(shí)間。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of incubation time on enzyme activity

2.3.3 料水比

在制曲過程中料水比是重要的指標(biāo)，合適的料水比有利于米根霉的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)出，較低的料水比會(huì)導(dǎo)致米根霉生長(zhǎng)遲緩，不利的生長(zhǎng)環(huán)境導(dǎo)致米根霉更容易生成孢子；較高的料水比會(huì)使原料表面生成水膜，導(dǎo)致氧氣的缺乏從而抑制米根霉的生長(zhǎng)，由圖6可知原料質(zhì)量40%的水為最佳條件。

圖6 料水比對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of material-water ratio on enzyme activity

2.3.4 培養(yǎng)溫度

由圖7可知在30 ℃時(shí)液化酶活力最高，糖化酶活力隨溫度的升高而升高；由于較高的溫度會(huì)消耗更多的能量，并且高溫易使制曲過程中水分蒸發(fā)過快，導(dǎo)致米根霉生長(zhǎng)環(huán)境惡化并產(chǎn)生大量孢子，同時(shí)也易生成大量雜菌，所以選擇30 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

圖7 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on enzyme activity

2.3.5 接種量

從圖8可以看出，隨著接種量的提高，曲的酶活力也隨之提高。按照種曲質(zhì)量與原料總質(zhì)量的百分比進(jìn)行接種。在接種量為3%時(shí)，糖化酶的活力最高；當(dāng)接種量為3.5%，液化酶的活力最高；當(dāng)接種量繼續(xù)提高時(shí)，由于菌體生長(zhǎng)受到營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的制約，將更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于自身的生長(zhǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低；因此綜合考慮選取3.5%為最佳接種量。

原青稞酒曲測(cè)定糖化酶活力為135.5 U/g，液化酶活力為25.6 U/g，優(yōu)化過后的自制純種曲糖化酶活力達(dá)到1 246.9 U/g，液化酶活力達(dá)到61.4 U/g，比原曲酶活力分別提高了9.2、2.4倍。

圖8 接種量對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of inoculum on enzyme activity

3 結(jié)果與討論

酒曲中的根霉屬和曲霉屬是起到糖化作用的微生物，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的結(jié)果，米根霉是起到主要作用的菌種。在青稞酒的發(fā)酵過程中，米根霉首先生長(zhǎng)繁殖并將青稞淀粉分解為酵母能夠利用的葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物是青稞酒的重要風(fēng)味物質(zhì)。發(fā)酵進(jìn)行到中期時(shí)，酵母開始成為優(yōu)勢(shì)菌，利用米根霉分解青稞淀粉產(chǎn)生的葡萄糖在完成自身的生長(zhǎng)繁殖后生產(chǎn)酒精；其余非優(yōu)勢(shì)菌種可能有生成青稞酒的特殊風(fēng)味物質(zhì)的作用。

實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法只分出4種微生物，證明酒曲中大部分微生物是很難在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出來(lái)的，而高通量測(cè)序法直接提取酒曲中的總DNA，然后采用通用引物進(jìn)行PCR得到初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，規(guī)避了實(shí)驗(yàn)室分離純化這一步驟，在減少工作量的同時(shí)大大提高了酒曲中微生物的檢測(cè)范圍。在青稞酒試發(fā)酵的過程中，發(fā)現(xiàn)存在有主要發(fā)酵作用的優(yōu)勢(shì)菌株，例如主要起到糖化液化作用的米根霉和產(chǎn)酒精作用的釀酒酵母，這些在發(fā)酵過程中數(shù)量有決定性優(yōu)勢(shì)的菌株不但能在發(fā)酵過程中分離出來(lái)，并且可以輕易地在酒曲中分離出來(lái)。酒曲中復(fù)雜的微生物環(huán)境一方面給予青稞酒獨(dú)特的風(fēng)味，另一方面可能存在生長(zhǎng)受到優(yōu)勢(shì)菌種抑制、對(duì)青稞酒的風(fēng)味沒有貢獻(xiàn)的菌種。利用高通量測(cè)序與實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)相結(jié)合的方法，可以篩選出在青稞酒發(fā)酵過程中起到主導(dǎo)作用的菌種，高通量測(cè)序可以較為全面地表現(xiàn)酒曲中微生物的多樣性，在確定優(yōu)勢(shì)菌群的同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些未知的微生物，豐富了微生物資源庫(kù)。

將主要的糖化菌株米根霉分離后制得的純種曲具有更高的糖化力和液化力，可以更加充分地利用青稞原料，從而減少生產(chǎn)成本；另一方面，利用單一菌種制曲和發(fā)酵更易控制生產(chǎn)流程，提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。單菌種發(fā)酵可能導(dǎo)致酒的風(fēng)味單一，解決這個(gè)問題是下一步研究的重點(diǎn)。

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