超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中12種青霉素類藥物殘留量

梁晶晶，沈丹，徐瀟穎，丁宇琦，羅金文*

1(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州， 310052) 2(通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，浙江 杭州， 310052)

青霉素族屬β-內(nèi)酰胺類抗生素，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁四肽側(cè)鏈和五肽交聯(lián)橋的結(jié)合來阻礙細(xì)胞壁合成，具有較強的殺菌作用，廣泛應(yīng)用于人和動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等疾病[1-2]。然而，部分養(yǎng)殖戶因其價格低廉、使用方便，在養(yǎng)殖過程中濫用青霉素類藥物，導(dǎo)致其在動物組織中蓄積殘留。青霉素在動物源性食品中的殘留會危害人體健康，破壞人類腸道的正常菌群環(huán)境，導(dǎo)致人體免疫力下降。為確保消費者的安全，我國及歐盟等組織均對動物組織中的青霉素類藥物殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定。如我國規(guī)定所有動物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中阿莫西林和氨芐西林的最高殘留限量為50 μg/kg，氯唑西林和苯唑西林的最高殘留限量300 μg/kg[3]。青霉素藥物殘留依然是人們關(guān)注的熱點。

目前，檢測青霉素類抗生素的方法主要有酶聯(lián)免疫法[4-5]、液相色譜法[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[9-11]。酶聯(lián)免疫法屬于半定量篩查方法，容易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象；液相色譜法檢測抗生素, 定性效果差，且不適合多殘留同步分析。近年來，液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)技術(shù)由于兼具液相色譜的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性特點，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段，但現(xiàn)有的方法都存在前處理步驟繁瑣，測定周期長等缺點。

PRiME HLB是一種最新型的固相萃取柱，是基于“N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物”填料的反相復(fù)合填料，該復(fù)合填料經(jīng)過特殊設(shè)計，對于動物源性食品中的蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等物質(zhì)具有特異性的吸附能力，且無需活化與平衡，樣品經(jīng)有機溶劑提取后，可直接上樣到小柱上，操作極其簡便，不會出現(xiàn)堵柱情況，最多只需3個步驟即可完成樣品制備過程，凈化速度可提高40%，凈化后，可以去除動物源性食品中蛋白、脂肪和磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，從而確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。此方法只需采用最簡單的過濾式樣品制備流程即可實現(xiàn)最潔凈的樣品凈化目標(biāo)，操作簡單、省時快速。本研究采用PRiME HLB樣品凈化技術(shù)，超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析手段，測定食品中12種青霉素族抗生素類藥物殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

AB5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 SCIEX)；甲醇，乙腈，甲酸(均為色譜純)；PRiME HLB固相萃取柱(Waters公司)；羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素和雙氯青霉(Dr.Ehrenstorfer)；甲氧苯青霉素和哌拉西林(USP),苯咪青霉素(北京振翔)，氘代青霉素G(WITEGE)。

實驗樣品：雞和鱸魚，取雞胸肉和鱸魚的肌肉部位進行試驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

對照品儲備液配制：分別精密稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品(羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、苯咪青霉素、甲氧苯青霉素、芐青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑青霉素、苯氧乙基青霉素、鄰氯青霉素、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素、哌拉西林)，分別用30%乙腈水溶解并定容至25 mL，各青霉素類抗生素儲備液濃度為500 μg/mL，于-18 ℃下存放。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：分別精密移取適量對照品儲備液，用水配制成約500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

同位素內(nèi)標(biāo)儲備液：取適量的氘代青霉素G鹽，用30%乙腈水溶解并定容至25 mL，同位素內(nèi)標(biāo)儲備液濃度為200 μg/mL，于-18 ℃下保存。

同位素內(nèi)標(biāo)工作液：用純水將同位素內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋500倍，配制成400 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.2 樣品前處理

精密稱取2.5 g樣品(準(zhǔn)確至0.01 g)于50 mL離心管中，精密加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液0.25 mL，加80%乙腈水溶液10 mL，渦旋混勻1 min，振蕩器振蕩30 min后，20 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，殘渣用7 mL 80%乙腈水溶液重復(fù)提取1次，合并上清液，用80%乙腈水溶液定容至20 mL，取5.0 mL加載到6CC規(guī)格的PRiME HLB 固相萃取柱，保持1 s 1滴的流速，取4 mL流出液于37 ℃下氮吹至小于0.7 mL，殘留液用純水定容至1.00 mL，過0.22 mL微孔濾膜，上LC-MS/MS測試。

1.2.3 空白基質(zhì)溶液的制備

取不含青霉素類藥物的空白樣品，除不加內(nèi)標(biāo)工作液外，同1.2.2處理，制得空白樣品基質(zhì)溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和內(nèi)標(biāo)工作液適量(標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物濃度應(yīng)與樣品待測液中一致)，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成5～100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.5 色譜與質(zhì)譜條件

液相采用CORTECS C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相為A：0.1%甲酸水，B：甲醇；梯度洗脫程序(B變化)：0～3 min，15%～50%；3～6 min，50%～70%；6～8 min，保持70%，8～8.1 min，70%～15%，8.1～12 min，保持15%；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子模式；電離電壓：5 500 v；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣流速：30 L/min；碰撞氣流量：30 L/min。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

CORTECS C18色譜柱采用不同鍵合相顆粒特性以及表面帶電修飾技術(shù)，具有柱效高、選擇性強，峰形好等優(yōu)點，本實驗以CORTECS C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)作為分析柱，對比了甲醇和乙腈作為有機相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇作為有機相時各目標(biāo)化合物的分離效果更好，因此選擇甲醇作為有機相。ESI電離是在溶液狀態(tài)電離，而在水相中加入0.1%甲酸時，各化合物在ESI+模式下的離子化效果更好，峰形有所改善，靈敏度也相應(yīng)提高，因此本實驗選取甲醇及0.1%甲酸水作為流動相。經(jīng)甲醇-水梯度洗脫所得的多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed standards solution

2.2 提取溶劑和復(fù)溶溶液的選擇

因考慮到甲醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羥基，會加速青霉素降解為青霉噻唑酸酯[12]，故選擇乙腈作為提取溶劑，預(yù)實驗采用70%乙腈水和70%乙腈水(含0.1%甲酸)2種溶液作為提取劑，結(jié)果表明，用70%乙腈水(含0.1%甲酸)提取后，部分化合物回收率較低，不到60%，如阿莫西林、苯氧乙基青霉素，分析原因，由于多種青霉素類藥物在酸性條件下不穩(wěn)定所致。隨后考察了70%乙腈水、80%乙腈水和90%乙腈水3種不同配比的提取劑對提取率的影響，結(jié)果表明，80%乙腈水對于各個化合物的提取效率最好，都能達到80%以上，沉淀蛋白完全，易于離心分離。因此，提取溶劑采用80%乙腈水，不加酸。

復(fù)溶溶液的選擇：對比了30%乙腈水溶液、30%甲醇水溶液和純水作為復(fù)溶液的色譜圖，發(fā)現(xiàn)采用30%乙腈水和30%甲醇水溶液復(fù)溶后，阿莫西林產(chǎn)生較強的溶劑效應(yīng)，呈現(xiàn)雙峰，而用純水復(fù)溶后的阿莫西林峰形較好，因此，選擇純水作為復(fù)溶液。

2.3 氮氣濃縮條件的選擇

為了對凈化后的提取液進行濃縮，提高檢測靈敏度，需對提取液進行氮吹。由于青霉素類藥物具有光不穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性的特點，在前處理操作中應(yīng)盡量避光、避熱，并且在較短的時間內(nèi)完成前處理過程，時間過長，溫度過高都會影響穩(wěn)定性，加速其降解，因此，需對氮吹的溫度進行研究與優(yōu)化。本實驗考察了30、37和45 ℃ 3個氮吹溫度條件下各個化合物的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在30 ℃和45 ℃條件下，部分化合物有不同程度的降解，導(dǎo)致回收率在60%～80%，而在37 ℃條件下則可達到80%以上的回收率，認(rèn)為是由于30℃溫度雖低，但導(dǎo)致氮吹時間過長，以及45 ℃溫度過高加速降解所致。因此，本實驗選擇37 ℃作為氮吹的最佳溫度。

2.4 方法學(xué)評價

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，本方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對青霉素類藥物進行分析。按照優(yōu)化后的色譜條件對12種青霉素類藥物做基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限含量(見表2)做基質(zhì)加標(biāo)。結(jié)果表明12種青霉素在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.998，信噪比均大于3，說明該方法檢出限能達到國標(biāo)方法規(guī)定的檢出限。

表2 12種青霉素族抗生素測定的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficient and limit of detection of 12 penicillins antibiotics

續(xù)表2

化合物保留時間/min線性范圍/(μg·L-1)回歸方程相關(guān)系數(shù)檢出限/(μg·kg-1)苯氧乙基青霉素5.817.26～145.2y1=0.038 2x-0.018 9y2=0.041 1x-0.014 40.999 80.999 910.0鄰氯青霉素5.724.22～84.4y1=0.053 4x-0.035 7y2=0.056 9x-0.042 60.999 30.999 41.0乙氧萘青霉素6.153.91～78.2y1=0.26x-0.128y2=0.271x-0.1550.999 80.999 70.25雙氯青霉素6.094.88～97.6y1=0.017 6x-0.006 21y2=0.015 7x-0.005 990.999 70.999 92.0哌拉西林4.825.27～105.4y1=0.061 2x-0.013 6y2=0.059 8x-0.016 90.998 90.999 31.0

注：y1代表以雞肉為基質(zhì)的回歸方程，y2代表以魚肉為基質(zhì)的回歸方程。

分別對雞肉和魚肉(均為陰性樣品)進行不同水平的加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)濃度分別為20、50、150 μg/kg，每一濃度進行6組平行實驗，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，各組分的平均回收率在81.7%～111.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～8.56%，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表3 12種青霉素族抗生素測定的回收率和精密度Table 3 recovery and precision of 12 penicillins antibiotics

2.5 實際樣品測定

從市場上抽取雞肉、豬肉和魚各10份，利用本方法對其進行青霉素類藥物殘留檢測，測定結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本實驗應(yīng)用PRiME HLB凈化技術(shù)，采用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法建立了動物源性食品中青霉素族抗生素類藥物殘留的檢測方法，各組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.998，平均回收率在81.7%～111.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.89%～8.56%，方法檢出限達到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢出限含量。因此，本方法用于動物源性食品中青霉素族抗生素藥物殘留檢測，具有準(zhǔn)確、快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點。

[1] 陳卓婧，閻淑男，夏瀾，等．農(nóng)產(chǎn)品中青霉素殘留檢測技術(shù)研究進展[J]．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,11:1 476-1 479.

[2] HOU J P,POOLE J W.Lactam antibiotics:their physicochemical properties and biological activities in relation to structure[J].J.Pharm.Sci.,1971,60(4):503-532.

[3] 動物性食品中獸藥最高殘留限量．農(nóng)業(yè)部235號公告，2002．

[4] 姜侃，厲永綱，沈泓，等．應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)建立鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶間接檢測方法[J]．中國食品衛(wèi)生雜志, 2013 , 25(5):405-409.

[5] SAMSONOVA,ZHVH，SHCHELOKOVA O S,IVANOVA N L,et aL.Enzyme immunoassay of ampicillin in milk [J].Pfikl Biokhim Mikrobiol,2005,41(6):668.

[6] 牛奶中青霉素類藥物殘留量的檢測方法-高效液相色譜法．農(nóng)業(yè)部781號公告，2006.

[7] GB 29682—2013．食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中青霉素類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法[S].

[8] ANG C Y,LUO W.Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid chromatography with fluorescence detection [J].JA O A CInt,1997,80(1):25-30.

[9] GB/T 22952—2008.河豚魚和鰻魚中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[10] GB/T 18932.25—2005.蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素殘留量的測定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[11] 郭萌萌，李兆新，譚志軍，等.分散固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的8種青霉素殘留[J].分析測試學(xué)報, 2011, 30(9):969-975.

[12] 馮月超 ，范筱京，賈麗，等．液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛奶中14種青霉素及相應(yīng)青霉噻唑酸殘留量[J].分析試驗室, 2012(9): 67-70.