慢病毒介導CDCA5敲低的三陰乳腺癌細胞的構建及鑒定

呂璐冶，黃燕，李萬金，韓秋影,宋楠，張學敏，周濤

國家生物醫(yī)學分析中心，北京 100850

乳腺癌是一類發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率位居女性腫瘤第一位，約占女性新發(fā)腫瘤的30%，致死人數(shù)占女性腫瘤死亡總人數(shù)的14%[2-4]。其中三陰乳腺癌（triple-negativebreast cancer）患者約占乳腺癌患者總體病例的20%，其特點是腫瘤細胞缺乏雌激素受體（estrogenreceptor，ER）、孕激素受體（progesteronereceptor，PR）和人表皮生長因子受體2（humanepidermalgrowthfactor receptor2，HER2）的表達[5-7]。與非三陰乳腺癌相比，三陰乳腺癌往往具有較快的腫瘤進程和較強的侵襲性，并且對化療響應差?；颊甙l(fā)病5年內(nèi)具有較高的復發(fā)率及死亡率[8-10]。目前臨床使用的主要治療手段如手術、放化療、免疫治療、內(nèi)分泌治療等，對三陰乳腺癌治療效果有限，因而尋找新的三陰乳腺癌治療靶點具有重要意義[9,11]。

細胞分裂周期相關蛋白5（celldivisioncy?cleassociated5，CDCA5）是細胞周期有絲分裂檢查點重要復合物——Cdh1激活的后期促進復合物（anaphase-promotingcomplex，APC）的底物，參與調(diào)節(jié)姐妹染色單體與黏連蛋白的結合[12-14]。CDCA5在脊椎動物中廣泛表達，保守性強，且在其他種類生物如酵母、爪蛙卵中存在同源基因，同樣參與調(diào)節(jié)黏連蛋白與染色體之間的相互作用[13]。有研究指出，敲除CDCA5顯著影響G2期細胞維持黏連蛋白與DNA穩(wěn)定結合[15]。近年研究發(fā)現(xiàn)CDCA5在多種亞型肺癌中高表達，超過70%的非小細胞肺癌呈CDCA5陽性，并且指示不良預后[16]。但是CDCA5作為癌基因，在乳腺癌及其他腫瘤中是否發(fā)揮作用有待研究。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術是一種能夠特異性敲低或沉默體內(nèi)目的基因表達的分子生物學技術[17-18]，具有高效、穩(wěn)定、特異性強、可遺傳等優(yōu)點，是生物學研究的重要工具[19-21]。慢病毒載體是一種基于逆轉錄病毒發(fā)展出的基因載體，能夠高效地將外源基因整合進宿主細胞，并持續(xù)穩(wěn)定表達。慢病毒載體的應用克服了瞬轉過程中轉染效率差、干擾RNA表達時間短等問題，目前在生物學研究中已得到廣泛應用。

本實驗室前期研究表明CDCA5蛋白在三陰乳腺癌患者癌組織中高表達，且與患者不良預后存在正相關，指示CDCA5在三陰乳腺癌中可能存在重要功能。為深入探討CDCA5在三陰乳腺癌增殖、轉移中的作用及相關分子機制，我們應用慢病毒感染體系和RNAi技術，構建了穩(wěn)定干涉CDCA5表達的三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231，為進一步研究提供重要的實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

MDA-MB-231細胞、用于病毒包裝的HEK293細胞來源于本實驗室細胞庫；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自Genstar科技有限公司；pLKO.1空載體質(zhì)粒（嘌呤霉素抗性）、對照組質(zhì)粒來源于本實驗室質(zhì)粒庫。

限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自Ther?moFisherScientific有限公司；核酸膠回收試劑盒、小提質(zhì)粒提取試劑盒均購自Promega公司；Opti-MEM、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鈣轉染試劑、抗生素（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶均購自邁晨科技有限公司；胎牛血清購自Hy?clone公司；2×上樣緩沖液購自北京鼎國科技有限公司；蛋白質(zhì)轉印PVDF膜購自GEHealthcare公司；免疫印跡用兔抗人CDCA5抗體購自SigmaAl?drich公司；鼠抗人Tubulin抗體購自CellSignal?lingTechnology公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗人二抗購自Jakson公司；ECL顯影試劑購自威哥拉斯公司；CellTiter96AqueousOneSolution CellProliferationAssay購自Promega公司。

細菌培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；PCR儀購自Biometra公司；恒溫金屬浴購自杭州恩盛公司；恒溫搖床購自上海恒智公司；細胞孵箱購自SANYO公司；藍光切膠儀購自無錫博弗瑞德公司；核酸電泳儀購自Bio-Rad公司；熒光儀購自TECAN公司；常溫高速離心機購自Sigma公司；低溫高速離心機購自Eppendorf公司；細胞操作臺購自Airtech公司。

1.2CDCA5短發(fā)夾RNA（shRNA）引物設計

在 PublicTRCPortal（https://portals.broadinsti?tute.org/gpp/public/）和 Sigma網(wǎng)站（https://www.sig?maaldrich.com/）在線設計人源CDCA5特異shRNA干涉序列，選擇其中2條得分較高且適用于pLKO.1載體構建的序列（表1、2）。

1.3CDCA5shRNA慢病毒質(zhì)粒的構建與鑒定

①將合成的CDCA5shRNA單鏈引物稀釋至10μmol/L，取互補的單鏈引物（1#F和1#R，或2#F和2#R）對應等量混勻；②取混合液5μL，加入5μL10×退火緩沖液、40μLddH2O配制成引物退火體系，置95℃水浴鍋中加熱15min，停止加熱4h后體系溫度達到室溫，完成退火；③取pLKO.1空載體質(zhì)粒5μg，加入10×緩沖液、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ各5μL，用ddH2O補齊至50μL酶切體系，于37℃水浴鍋中酶切1h；④將酶切產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖核酸膠中，130V恒壓進行凝膠電泳，根據(jù)酶切位點確定目的片段大小并切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收載體酶切DNA片段；⑤各取回收的pLKO.1酶切片段和shRNA引物1μL退火，加入T4DNA連接酶和緩沖液各1μL，與6μLddH2O混合均勻，室溫連接2h；⑥將30μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞置于冰上，加入5μL連接產(chǎn)物混勻，配制成轉化體系，30min后在42℃水浴鍋熱激90s，迅速冰浴10min；⑦向轉化體系中加入無抗LB液體培養(yǎng)基500 μL，37℃搖床孵育1h，3000r/min常溫離心3min后棄300μL上清，重懸菌液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素），37℃細菌孵箱中過夜；⑧用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和AgeⅠ對LB固體培養(yǎng)基中的單克隆進行雙酶切，產(chǎn)物通過核酸膠電泳鑒定；⑨選取有明顯條帶的陽性單克隆菌落分別加入5mLLB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）進行培養(yǎng)，用試劑盒提取質(zhì)粒并測序。

表1 CDCA5干涉靶序列

表2CDCA5shRNA引物序列

1.4 病毒包裝、感染

在10cm培養(yǎng)皿內(nèi)接種1×106HEK293細胞，待細胞貼壁，細胞密度達到50%左右時進行病毒包裝：①將 VSVG（1.5 μg）、PAX2（4.5 μg）、對照組質(zhì)?；駽DCA5干涉質(zhì)粒（6μg）加入1mL HBS中，輕柔混勻，室溫靜置5min；②向該混合液中緩慢加入67μLCaCl2，混勻后室溫靜置15 min；③將混合液逐滴均勻加入HEK293細胞中，轉染10h后更換為10mLDMEM完全培養(yǎng)基；④分別于轉染后48和72h收集病毒，48h第一次收集培養(yǎng)上清并補加新鮮培養(yǎng)基，室溫1500r/min離心5min，取上清在50mL離心管中于4℃保存，72h第二次收集病毒；⑤將2次收集的上清液混勻，1500r/min離心5min；⑥取培養(yǎng)基上清加入病毒濃縮柱中，6000r/min低溫離心30 min，收集濾芯中含病毒培養(yǎng)基，-80℃儲存；⑦將2×106MDA-MB-231細胞接種于10cm培養(yǎng)皿，待完全貼壁后更換為10mL含8μL促感染劑聚凝胺（Polybrane）的RPMI1640完全培養(yǎng)基；⑧向MDA-MB-231細胞中均勻滴加濃縮后病毒，恒溫細胞孵箱培養(yǎng)24h；⑨撤去含病毒培養(yǎng)基，更換為含嘌呤霉素（2μg/mL）的RPMI1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞無大面積死亡，完成篩選。

1.5 細胞感染后的干涉效果和增殖能力檢測

將用嘌呤毒素篩選過的表達穩(wěn)定干涉質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞培養(yǎng)皿置于冰上，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，用細胞裂解液（20mmol/L pH7.4Tris-HCl，3mmol/LEDTA，3mmol/LEG?TA，0.5%NP40，250mmol/LNaCl，50×Cocktail）裂解10min，收集裂解產(chǎn)物，12000r/min低溫離心3min，收集上清加入等量2×上樣緩沖液混勻，105℃金屬浴加熱30min，使樣品蛋白質(zhì)充分變性，用Western印跡檢測CDCA5蛋白的表達水平。

將篩選后的MDA-MB-231細胞進行消化處理，將對照組和干涉組細胞用臺盼藍進行活細胞計數(shù)，種入7個96孔板中，每孔接種2×103細胞，每種細胞種3個復孔，分別于接種培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120、144h檢測每孔細胞活力。

2 結果

2.1 pLKO.1-CDCA5-shRNA質(zhì)粒構建

利用數(shù)據(jù)庫信息設計了特異針對人源CDCA5進行干涉的引物序列。將退火引物加入DNA核酸膠中進行電泳，發(fā)現(xiàn)核酸凝膠最前端出現(xiàn)明顯條帶（圖1），表明引物退火成功。根據(jù)需求選取EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位點對pLKO.1空載體進行雙酶切。將載體片段與退火產(chǎn)物進行連接，構建pLKO.1-CDCA5-shRNA質(zhì)粒。

2.2 菌液鑒定與質(zhì)粒測序

將2種CDCA5干涉質(zhì)粒進行轉化后，分別挑選2株單克隆進行菌落酶切鑒定。PCR產(chǎn)物DNA凝膠電泳結果如圖2，核酸膠中1#、2#干涉質(zhì)粒菌落均有明顯條帶，表明pLKO.1-CDCA5-shRNA質(zhì)粒構建成功。培養(yǎng)陽性菌落，提取質(zhì)粒并測序，將測序結果與shCDCA5-mRNA進行堿基序列比對，發(fā)現(xiàn)特異性干涉CDCA5基因的DNA片段成功插入pLKO.1空載體（圖3），表明pLKO.1-CDCA5-shRNA質(zhì)粒構建成功。

2.3 MDA-MB-231中敲低CDCA5的干涉效果檢測

將對照組質(zhì)粒與干涉組質(zhì)粒用磷酸鈣轉染法進行病毒包裝，收集48與72h含病毒培養(yǎng)基，用100k病毒濃縮柱濃縮病毒，感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，24h后進行抗性篩選。收集篩選得到的穩(wěn)定表達干涉質(zhì)粒的細胞樣品，通過Western印跡檢測CDCA5蛋白質(zhì)表達水平，結果見圖4，與對照組相比，表達1#、2#干涉質(zhì)粒的細胞CDCA5蛋白表達水平顯著降低，2條干涉序列對CDCA5敲低效果明顯。

圖1CDCA5干涉序列引物退火結果

圖2 菌落酶切鑒定結果

圖3 pLKO.1-CDCA5-shRNA質(zhì)粒測序

2.4 MDA-MB-231中敲低CDCA5后顯著抑制細胞增殖能力

細胞完成病毒感染、抗性篩選后，計數(shù)種入96孔板，用 CellTiter96AqueousOneSolution CellProliferationAssay分別檢測接種后第0、24、48、72、96、120、144h的細胞活力。結果顯示，敲低CDCA5能顯著抑制MDA-MB-231的細胞增殖能力（圖5）。

3 討論

乳腺癌是女性常見的癌癥和主要的癌癥致死原因[1-4]。隨著社會發(fā)展、人口老齡化、生化壓力增大及生態(tài)環(huán)境的惡化，乳腺癌發(fā)病率和復發(fā)率逐漸升高，并已成為威脅人類生存與社會發(fā)展的嚴重疾病和重大公共衛(wèi)生問題[3]。而三陰乳腺癌因其惡性程度高、對化療的不敏感及缺乏ER、PR、HER2等常規(guī)靶點的表達，從發(fā)現(xiàn)以來便成為人們想要解決的重點問題[5-7,11]。因此，探索和發(fā)現(xiàn)三陰乳腺癌中新的基因靶點具有重大意義。

圖4CDCA5shRNA敲低CDCA5基因的效果檢測

CDCA5在人體多個組織器官中高表達，如骨髓、睪丸、胃、淋巴結、脾臟等，并且在一些癌細胞中也明顯高表達，如非小細胞肺癌、口腔鱗狀細胞癌、前列腺癌、胃癌等[16,22-24]。且文獻報道其與ERK通路、周期蛋白E1等具有相互作用，指示其在癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用，但是CDCA5在三陰乳腺癌中的生理學功能還有待探索[16,23-24]。

前期，我們通過大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CDCA5在三陰乳腺癌細胞中高表達。為了研究CDCA5在三陰乳腺癌中的調(diào)控功能，本實驗室利用RNAi技術和慢病毒感染體系，構建了穩(wěn)定干涉CDCA5的MDA-MB-231細胞系。在隨后的細胞活力檢測實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在干涉CDCA5后能夠顯著抑制三陰乳腺癌細胞的增殖能力，表明CDCA5在人三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖過程中發(fā)揮重要作用。那么CDCA5在三陰乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中是否具有調(diào)控作用，以及CDCA5對三陰乳腺癌患者抵抗放化療及復發(fā)具有怎樣的影響？本研究將為我們進一步探索CDCA5在三陰乳腺癌中的功能及相應機制提供實驗基礎。

圖5 敲低CDCA5抑制MDA-MB-231細胞增殖能力