• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于轉(zhuǎn)錄組測序分析宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒16感染對泛素蛋白連接酶、核因子-κB表達(dá)的影響

    2018-06-13 01:28:18馬敏麗美力班吐爾遜王振芳阿仙姑哈斯木
    關(guān)鍵詞:核因子宮頸癌

    馬敏麗,美力班·吐爾遜,王振芳,阿仙姑·哈斯木

    (1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,烏魯木齊 830011;2解放軍第四七四醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830013;3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室,烏魯木齊 830011)

    基于轉(zhuǎn)錄組測序分析宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒16感染對泛素蛋白連接酶、核因子-κB表達(dá)的影響

    馬敏麗1,2,美力班·吐爾遜3,王振芳1,阿仙姑·哈斯木3

    (1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院,烏魯木齊830011;2解放軍第四七四醫(yī)院病理科,烏魯木齊830013;3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室,烏魯木齊830011)

    摘要:目的探討新疆婦女宮頸病變中Toll樣受體9(TLR9)和泛素蛋白連接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表達(dá)與人乳頭狀瘤病毒16(HPV16)感染的關(guān)系。方法以人乳頭瘤病毒(HPV)分型基因芯片檢測86例慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌組織HPV感染及分型;Illumina Hiseq測序平臺(tái)對15例宮頸病變組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序;通過免疫組化SP法檢測TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CINⅡ-Ⅲ 和宮頸癌患者石蠟包埋組織中的表達(dá)水平。結(jié)果宮頸癌的HPV感染率為100%(41/41),CINⅡ-Ⅲ的感染率為60%(15/25),慢性宮頸炎的感染率為15%(3/20),其中HPV16為主要感染型別;轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達(dá)的基因有12個(gè)(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2);免疫組化結(jié)果顯示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宮頸癌組織中高表達(dá),其表達(dá)水平呈正相關(guān)(r分別為0.510和0.469,P值均<0.001)。結(jié)論在宮頸癌發(fā)展過程中,HPV16感染可能通過泛素-蛋白酶體降解途徑影響TLR9 蛋白表達(dá),具體調(diào)控機(jī)制需要深入研究。

    關(guān)鍵詞:宮頸癌;人乳頭狀瘤病毒16;Toll樣受體9;泛素蛋白連接酶;核因子-κB

    中圖分類號(hào):R737.33

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1009-5551(2018)05-0534-05

    doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

    基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金(2017D01C227)

    作者簡介:馬敏麗(1983- ),女,在讀碩士,研究方向:腫瘤分子生物學(xué)。

    通信作者:阿仙姑·哈斯木,女,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:婦科腫瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

    本文引用:馬敏麗,美力班·吐爾遜,王振芳,等.基于轉(zhuǎn)錄組測序分析宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒16感染對泛素蛋白連接酶、核因子-κB表達(dá)的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,41(5):534-538.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

    EffectofHPV16infectionontheexpressionofUBCandNF-κBincervicallesionsbasedontranscriptomesequencing

    MAMinli1,2,MeilibanTuerxun3,WANGZhenfang1,AxianguHasimu3

    (1GraduateSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2No.474People′sLiberationArmyHospital,Urumqi830013;3DepartmentofPathologyandAnatomy,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

    Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expressions of Toll-like receptor 9(TLR9),Ubiquitin ligases(UBC),Nuclear factor-κB(NF-κB)and human papilloma-virus(HPV)16 in cervical lesions of Xinjiang women.MethodsEighty-six cases of Uyghur chronic cervicitis,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical cancer HPV infection and typing were detected by HPV typing gene chip;Illumina Hiseq sequencing platform was used for transcriptome sequencing of 15 cervical lesion tissues.The expression of TLR9,UBC and NF-κB in paraffin-embedded tissues of patients with chronic cervicitis,CIN Ⅱ-Ⅲ and cervical cancer were detected by immunohistochemical SP method.ResultsThe HPV infection rate of cervical cancer was 100%(41/41),the infection rate of CIN Ⅱ-Ⅲ was 60%(15/25),and the infection rate of chronic cervicitis was 15%(3/20),of which HPV16 was the major infection type.Transcriptome sequencing results showed that there were 12 TLR9-related different up-regulated genes(TLR9,NF-κB,UBC,TICAM1,POU2F3,S100A8,NOD2,CDK1,FOS,JUN,MAL and IRF7)in HPV16-positive cervical cancer and CIN Ⅱ-Ⅲ tissue.Immunohistochemistry results showed that TLR9,UBC9 and NF-κB were highly expressed in CIN and cervical cancer tissues,and their expression levels were positively correlated(r=0.510 and 0.469,P<0.001,respectively).ConclusionHPV16 infection may affect the expression of TLR9 protein in women through the ubiquitin-proteasomal degradation pathway,in which the specific regulatory mechanisms need to be further studied.

    Keywords:cervical cancer;human papillomavirus 16(HPV 16);cervical cancer;Toll-like receptor 9(TLR9);ubiquitin ligases(UBC);nuclear factor-κB(NF-κB)

    人乳頭瘤病毒(HPV)是導(dǎo)致宮頸癌病變的主要因素,尤其是高危型HPV16、18長期持續(xù)感染是引起宮頸上皮癌變的重要原因[1]。Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)家族在早期固有免疫中對入侵病原微生物的識(shí)別發(fā)揮重要作用[2-3]。目前,已發(fā)現(xiàn)的人類TLR家族成員中識(shí)別病毒的有:TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和 TLR9,其中TLR9能識(shí)別細(xì)菌、病毒的核酸成分,通過介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[4-5]。課題組前期在宮頸癌組織標(biāo)本以及宮頸癌細(xì)胞系中,對TLRs及相關(guān)分子進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)HPV16 陽性宮頸癌組織和細(xì)胞系中TLR9表達(dá)缺失[6];并且利用RNAi技術(shù)抑制HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞中E6、E7 mRNA表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA干擾引起腫瘤細(xì)胞表面TLR9分子的重新表達(dá)。以上研究證明宮頸癌組織TLR9表達(dá)缺陷與高危型HPV16編碼的E6、E7蛋白有密切聯(lián)系[7]。可見,TLR9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控發(fā)生異??赡苁荋PV和腫瘤細(xì)胞賴以生存的必要前提或必然結(jié)果[8]。目前關(guān)于任何TLR及其功能途徑、宮頸癌進(jìn)程和HPV感染等三者之間關(guān)系尚未形成系統(tǒng)認(rèn)識(shí),甚至對TLR9表達(dá)調(diào)控與宮頸癌的關(guān)系也存在爭議。綜上,本課題旨在探討新疆婦女宮頸病變中TLR9和泛素蛋白連接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表達(dá)與HPV16感染的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1研究對象收集2015-2017年在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)診斷確診的慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌(CSCC)患者的石蠟包埋組織標(biāo)本共86例。其中包括慢性宮頸炎石蠟包埋標(biāo)本20例,CINⅡ-Ⅲ石蠟包埋標(biāo)本25例,宮頸癌石蠟包埋標(biāo)本41例(高分化鱗癌21例,中低分化鱗癌20例)。其中15例宮頸病變新鮮組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(分別為正常宮頸HPV陰性、正常宮頸HPV16陽性、CINⅡ-Ⅲ HPV16陰性、CINⅡ-Ⅲ HPV16陽性和宮頸癌HPV16陽性組織各3例)。

    1.2主要儀器與試劑ABI9700PCR擴(kuò)增儀、Illumina Hiseq測序平臺(tái)。免疫組化SP法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、UBC兔抗人多克隆抗體[Abcam(上海)貿(mào)易有限公司]、NF-κB兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和TLR9兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

    Arzberg在 1920 年末與Hermann Gretsch大師合作推出新系列“1382”而名垂千史,該系列產(chǎn)品從1931 年便炙手可熱,有一位評論家給“1382”極高的評價(jià),稱之“實(shí)用、樸實(shí),簡潔的風(fēng)格比膚淺的時(shí)尚更具經(jīng)典意義”。

    1.3方法

    1.3.1組織HPV基因型檢測采用ABI9700PCR擴(kuò)增儀和人乳頭瘤病毒(HPV)分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)(HPV-GenoCam-9600)進(jìn)行結(jié)果判讀。提取組織DNA,取2μL待測DNA樣品分別加至上述PCR反應(yīng)管中。PCR的循環(huán)參數(shù)設(shè)定為:預(yù)變性50℃2min,95℃10min,然后95℃30s,52℃45s,65℃30s,共40循環(huán),總延伸65℃5min,擴(kuò)增完畢后將產(chǎn)物保存在-20℃冰箱。DNA雜交:轉(zhuǎn)移基因芯片至96孔板內(nèi),取30μL的NaOH變性液加入PCR產(chǎn)物管,靜置10min。100μL的雜交液和60μL變性的PCR產(chǎn)物分別加入芯片孔中,在55℃下溫育30min,并吸干孔內(nèi)的液體。再加入150μL洗液B,漂洗3min,再次吸干液體;重復(fù)2次。顯色:取100μL的酶標(biāo)工作液,加入芯片孔內(nèi),在37℃下溫育30min;將孔內(nèi)液體吸干。再分別加入顯色液A水溶液和顯色液B,兩者均為50μL,輕搖混勻,于室溫下顯色5min,然后將孔內(nèi)液體吸干,并加入150μL洗液C,靜置1min,并吸干。使用HPV分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)對基因芯片進(jìn)行檢測和分析。HPV-GenoCam-9600系統(tǒng)自動(dòng)檢測靶點(diǎn)信號(hào)Intensity Value值(INS),分析并報(bào)告結(jié)果:INS<11.0為HPV 陰性;INS≥11.0為HPV陽性,并報(bào)告HPV的型別。

    1.3.2基于HiSeq 平臺(tái)對宮頸病變組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的測序 實(shí)驗(yàn)采用Illumina TruseqTM RNA 試劑盒方法構(gòu)建文庫。(1)提取總RNA、富集mRNA:從組織中提取總RNA,用Nanodrop 2000 檢測所提取的RNA 的濃度和純度,通過瓊脂糖凝膠電泳法來檢測RNA 的完整性,再用Agilent2100 測定RIN值。用帶有Oligo(dT)的磁珠與ployA 進(jìn)行A-T 堿基配對,將mRNA從總RNA中分離出來,用于分析轉(zhuǎn)錄組信息。(2)mRNA的片段化:富集所獲得的mRNA序列是完整的,長度達(dá)幾kb,因此要將其隨機(jī)打斷。(3)cDNA的合成:加入六堿基隨機(jī)引物并通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用,以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA,隨后進(jìn)行二鏈合成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。(4)連接adaptor并Illumina Hiseq 4000 上機(jī)測序。

    1.3.3采用免疫組織化學(xué)法檢測TLR9和UBC、NF-κB蛋白表達(dá)情況用免疫組織化學(xué)SP法檢測法,切片常規(guī)脫蠟,梯度乙醇水化及抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,滴加一抗(TLR9、UBC和NF-κB兔抗人多克隆抗體濃度分別為1∶250、1∶500和1∶300),并放入4℃冰箱里過夜,用PBS作為陰性對照。第2天加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,室溫下孵育30min。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明和封片。判斷結(jié)果,采用人工計(jì)數(shù)方法按染色細(xì)胞數(shù)和染色程度綜合計(jì)分。光學(xué)顯微鏡下全視野觀察,每張切片按所見陽性細(xì)胞范圍分為4個(gè)分值,陽性細(xì)胞范圍<5%記0分,5%~25%記1分,26%~75%記2分;>75%記3分。染色強(qiáng)度的判定:陰性染色記0分,弱陽性染色記1分,陽性染色記2分,強(qiáng)陽性染色記3分。綜合積分=(染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)+染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))/2。

    2 結(jié)果

    2.1宮頸病變中HPV感染和基因型分布對86例宮頸病變標(biāo)本進(jìn)行HPV的檢測,其中包括宮頸癌41例,CINⅡ-Ⅲ 25例,慢性宮頸炎組織20例。宮頸癌的感染率為100%(41/41),CINⅡ-Ⅲ的感染率為60%(15/25),慢性宮頸炎的感染率為15%(3/20)。在HPV陽性的標(biāo)本中有11個(gè)HPV基因型,在66例宮頸癌及CINⅡ-Ⅲ組織中有10例為多重感染,多重感染率為15.1%(10/66)。在20例慢性宮頸炎組織中有3例感染了HPV,且都是HPV16陽性。在檢測到的12個(gè)HPV基因型中高危型為10個(gè),低危型2個(gè)。宮頸癌及CINⅡ-Ⅲ的HPV基因型分布,見圖1。

    2.2宮頸病變中與HPV16感染和TLR9相關(guān)的差異表達(dá)基因使用Illumina Hiseq測序平臺(tái)4000對宮頸病變組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,構(gòu)建Illumina PE文庫(200bp)進(jìn)行2×151bp測序,對獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,之后利用生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達(dá)的基因有12個(gè),見表1。

    表1 HPV16陽性宮頸癌和CIN組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達(dá)的基因

    2.3宮頸病變中TLR9、UBC和NF-κB蛋白表達(dá)TLR9、UBC和NF-κB在病變宮頸組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá),TLR9主要表達(dá)在病變宮頸鱗狀上皮的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),UBC主要表達(dá)在病變宮頸鱗狀上皮的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),NF-κB主要表達(dá)在病變宮頸鱗狀上皮的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),見圖2。

    TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌中呈不同程度的陽性表達(dá)。在慢性宮頸炎組織中陽性表達(dá)率分別為40%、25%、50%,在CIN組織中陽性表達(dá)率分別為100%、88%、88%,在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率分別為54%、73%、73%。隨著宮頸病變程度的加重,TLR9、UBC和NF-κB的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    2.4TLR9與UBC9、NF-κB表達(dá)水平的相關(guān)性TLR9在宮頸病變組織中的高表達(dá)與UBC、NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05),Spearman相關(guān)系數(shù)r值分別為0.510和0469。UBC和NF-κB的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.488,P<0.05),見表3、4。

    慢性宮頸炎組織 CIN組織 宮頸癌組織

    圖2 TLR9、UBC、NF-κB在宮頸各組織中的表達(dá)(×200)

    表2TLR9、UBC和IκBα在不同宮頸組織中的表達(dá)情況/例(%)

    分類例數(shù)TLR9陽性陰性χ2值P值UBC陽性陰性χ2值P值NF-κB陽性陰性χ2值P值慢性宮頸炎組織208(40.0)12(60.0)5(25.0)15(75.0)10(50.0)10(50.0)CIN組織2525(100.0)0(0.0)20.6320.00022(88.0)3(12.0)21.3970.00022(88.0)3(12.0)8.020.018宮頸癌組織4122(53.7)19(46.3)30(73.1)11(26.9)30(73.1)11(26.9)

    表3 不同宮頸組織中TLR9與UBC、NF-κB表達(dá)的相關(guān)性/例

    表4 不同宮頸組織中UBC與NF-κB表達(dá)的相關(guān)性/例

    3 討論

    宮頸癌是病因較明確的女性惡性腫瘤,80%的宮頸癌患者都能檢測到高危型HPV的感染[9-10]。但絕大多數(shù)女性的感染為一過性感染,可在12~18個(gè)月內(nèi)消除,只有少數(shù)(2%~3%)感染者免疫監(jiān)視和清除功能失敗導(dǎo)致其發(fā)展為宮頸癌[11]。所以機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)功能障礙被認(rèn)為是HPV持續(xù)性感染并發(fā)展致癌的重要原因。

    TLR9作為TLRs家族重要成員之一,和絕大部分TLRs共享髓系分化因子88(MyD88)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]。Liu等[13]、Sato等[14]的研究示當(dāng)TLR9被配體激活后,MyD88將TIR二聚體與IRAK蛋白激酶連接,后者通過磷酸化激活泛素連接酶UBC,再經(jīng)過多步反應(yīng),使NF-κB活化核轉(zhuǎn),導(dǎo)致免疫應(yīng)答基因的激活,從而誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(IL-6),腫瘤壞死因子α(TNF-α),干擾素α、β(IFN-α、β)和某些黏附分子等的表達(dá),從而抑制細(xì)菌、病毒等病原體的感染。

    本研究納入86例宮頸病變組織標(biāo)本,其中包括41例宮頸癌、25例CINⅡ-Ⅲ、20例慢性宮頸炎組織,分別對其進(jìn)行HPV基因型檢測、轉(zhuǎn)錄組測序和免疫組織化學(xué)染色分析。通過HPV基因型的檢測,發(fā)現(xiàn)宮頸癌、 CINⅡ-Ⅲ和慢性宮頸炎的HPV感染率分別為100%、60%、 15%。并在HPV陽性的標(biāo)本中共檢測到11個(gè)HPV基因型,其中以HPV16為主要感染型別。并從中選取了15例宮頸病變組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達(dá)的基因有12個(gè),其中就包括UBC和NF-κB,因此我們推測UBC和NF-κB是與HPV16感染相關(guān)的TLR9靶基因。再以良性病變慢性宮頸炎為對照,通過免疫組織化學(xué)篩查分析,發(fā)現(xiàn)TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌組織中呈不同程度的陽性表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說明TLR9參與了宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的進(jìn)程。且TLR9與UBC、NF-κB表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r分別為0.510和0.469,P值均<0.001)。提示TLR9可能通過其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活UBC、NF-κB,并進(jìn)一步通過NF-κB的下游靶基因的激活在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用。由此說明本研究進(jìn)一步支持在宮頸癌發(fā)展過程中,HPV16感染可能通過泛素- 蛋白酶體降解途徑影響TLR9 蛋白表達(dá),但其具體調(diào)控機(jī)制還需要深入研究。

    目前,TLR9在宮頸癌中所介導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不明確,只有通過多種TLR相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控水平篩查分析,鑒別出宮頸癌特異性TLR信號(hào)通路,才能深入開展TLR介導(dǎo)的天然免疫與宮頸癌進(jìn)程之間相互作用的機(jī)制研究。在此過程中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵信號(hào)分子也可為將來宮頸癌的藥物治療提供新的靶點(diǎn)。

    [收稿日期:2018-02-27]

    (本文編輯楊晨晨)

    猜你喜歡
    核因子宮頸癌
    中老年女性的宮頸癌預(yù)防
    預(yù)防宮頸癌,篩查怎么做
    枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其抑制NF—κB,TNF—α,IL—6 和 IL—1β表達(dá)的機(jī)制
    E-cadherin、Ezrin在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    食管疾病(2015年3期)2015-12-05 01:45:07
    核因子—κBp65對肝門靜脈海綿樣變性大鼠門靜脈及其周圍組織中血管內(nèi)皮生長因子、腫瘤壞死因子—α、內(nèi)皮素表達(dá)的影響
    瑞舒伐他汀對肥胖大鼠心肌NF—κB表達(dá)的影響
    芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜核因子—κB DNA結(jié)合活性的影響
    白藜蘆醇對慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κB的抑制作用
    芬太尼聯(lián)合丙泊酚對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
    Survivin、NF-кB和STAT3 mRNA在宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義
    91精品国产国语对白视频| 熟女av电影| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲美女黄色视频免费看| 免费av中文字幕在线| 女性被躁到高潮视频| 99久久人妻综合| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品人妻久久久影院| 日日爽夜夜爽网站| 国产爽快片一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老熟女久久久| 国产av精品麻豆| 日本wwww免费看| av在线播放精品| 亚洲成人免费电影在线观看 | 人人妻人人澡人人看| 久久综合国产亚洲精品| 国产高清视频在线播放一区 | 一区二区三区精品91| 欧美中文综合在线视频| 少妇 在线观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美在线一区亚洲| 国产人伦9x9x在线观看| 99热全是精品| 十八禁网站网址无遮挡| 午夜老司机福利片| 婷婷色综合www| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲av男天堂| 五月天丁香电影| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 丝袜美腿诱惑在线| 精品久久蜜臀av无| 老司机亚洲免费影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 真人做人爱边吃奶动态| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲欧美在线一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av片东京热男人的天堂| 国产片内射在线| netflix在线观看网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美97在线视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 91国产中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜激情久久久久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 人妻人人澡人人爽人人| 免费看av在线观看网站| 婷婷色av中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 69精品国产乱码久久久| 操出白浆在线播放| 国产色视频综合| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲人成电影观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品久久久久久电影网| 成人三级做爰电影| 午夜免费鲁丝| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 18禁观看日本| 欧美在线黄色| 18禁国产床啪视频网站| 人体艺术视频欧美日本| 波多野结衣一区麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 婷婷色综合大香蕉| 九色亚洲精品在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 男女国产视频网站| 精品第一国产精品| 午夜日韩欧美国产| 国产日韩欧美视频二区| 91字幕亚洲| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日本中文国产一区发布| 男女之事视频高清在线观看 | 国产97色在线日韩免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产淫语在线视频| 青草久久国产| 色播在线永久视频| 一区福利在线观看| 两性夫妻黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 国产深夜福利视频在线观看| 大型av网站在线播放| 美女扒开内裤让男人捅视频| 热re99久久精品国产66热6| 在线精品无人区一区二区三| 日本vs欧美在线观看视频| 美女福利国产在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美日韩av久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 丝袜美腿诱惑在线| 国产人伦9x9x在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 十八禁高潮呻吟视频| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品人妻久久久影院| 国产片特级美女逼逼视频| 婷婷色av中文字幕| 国产在线免费精品| 美女主播在线视频| 国产视频首页在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 大陆偷拍与自拍| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 宅男免费午夜| 免费在线观看黄色视频的| 一级毛片我不卡| 欧美精品高潮呻吟av久久| 大型av网站在线播放| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩黄片免| 岛国毛片在线播放| 首页视频小说图片口味搜索 | 国产精品偷伦视频观看了| 国产av国产精品国产| av在线app专区| 欧美在线一区亚洲| 高清不卡的av网站| 国产又爽黄色视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲伊人色综图| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品三级大全| 国产爽快片一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 成人国语在线视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品亚洲av一区麻豆| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品国产av在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 一区在线观看完整版| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 精品久久蜜臀av无| 久久青草综合色| 一级黄片播放器| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品av久久久久免费| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品一国产av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 又紧又爽又黄一区二区| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久九九热精品免费| 欧美另类一区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲第一av免费看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产精品 国内视频| e午夜精品久久久久久久| 青青草视频在线视频观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一区福利在线观看| 亚洲国产av新网站| 一级a爱视频在线免费观看| 久久狼人影院| 交换朋友夫妻互换小说| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产在线一区二区三区精| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 大香蕉久久成人网| av一本久久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久久久久国产电影| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 极品人妻少妇av视频| 午夜久久久在线观看| 婷婷丁香在线五月| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中文字幕av电影在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 国产成人欧美在线观看 | 午夜两性在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产老妇伦熟女老妇高清| 热99国产精品久久久久久7| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 九色亚洲精品在线播放| av在线老鸭窝| 天堂中文最新版在线下载| av天堂久久9| 嫩草影视91久久| 国产精品 国内视频| 真人做人爱边吃奶动态| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品国产一区二区久久| 亚洲成人免费电影在线观看 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一级毛片电影观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩大码丰满熟妇| 99国产精品一区二区三区| 天堂√8在线中文| 成人亚洲精品av一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久久国产成人免费| 搞女人的毛片| 国产精品,欧美在线| 日韩视频一区二区在线观看| 国产乱人伦免费视频| 日本成人三级电影网站| 国产成人系列免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久精品成人免费网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 啦啦啦 在线观看视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 级片在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 久久久久亚洲av毛片大全| a级毛片a级免费在线| 在线观看免费午夜福利视频| 日本成人三级电影网站| 国产成人精品久久二区二区91| 丁香六月欧美| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久久国产成人免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄片播放在线免费| 国产免费av片在线观看野外av| 国内精品久久久久久久电影| 国产高清视频在线播放一区| 禁无遮挡网站| 精品不卡国产一区二区三区| av视频在线观看入口| 一级毛片高清免费大全| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人18禁在线播放| 美女免费视频网站| 成人国语在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产日本99.免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 无限看片的www在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 1024香蕉在线观看| 免费高清在线观看日韩| 国产成人精品无人区| 成年人黄色毛片网站| 免费在线观看亚洲国产| 91大片在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品影院久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人精品久久二区二区91| 日韩有码中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲av电影不卡..在线观看| 正在播放国产对白刺激| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 白带黄色成豆腐渣| 国产99白浆流出| 丁香欧美五月| 亚洲av美国av| 一夜夜www| 黄色丝袜av网址大全| 熟女电影av网| 99在线人妻在线中文字幕| 两人在一起打扑克的视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲,欧美精品.| 一边摸一边抽搐一进一小说| 黄色a级毛片大全视频| 波多野结衣av一区二区av| 国产成人精品无人区| 午夜久久久在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 午夜福利免费观看在线| 99久久综合精品五月天人人| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人国语在线视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 日韩av在线大香蕉| 中文在线观看免费www的网站 | 国产乱人伦免费视频| 99精品在免费线老司机午夜| 中国美女看黄片| 看免费av毛片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久久久久久精品吃奶| 国内精品久久久久精免费| 美女午夜性视频免费| 99在线视频只有这里精品首页| 美国免费a级毛片| 久久99热这里只有精品18| 国产麻豆成人av免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| a级毛片a级免费在线| 午夜久久久久精精品| 免费在线观看影片大全网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美日韩精品网址| 在线天堂中文资源库| 少妇的丰满在线观看| 一区二区三区激情视频| 成在线人永久免费视频| 国产片内射在线| 男人舔奶头视频| 久久亚洲真实| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 1024视频免费在线观看| 看片在线看免费视频| 99re在线观看精品视频| 后天国语完整版免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲第一青青草原| 亚洲精品国产一区二区精华液| 啦啦啦免费观看视频1| 精品久久蜜臀av无| 在线观看一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 香蕉国产在线看| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美 国产精品| 午夜亚洲福利在线播放| 热99re8久久精品国产| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美激情 高清一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 69av精品久久久久久| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 99热这里只有精品一区 | 国产伦人伦偷精品视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产乱人伦免费视频| 99在线人妻在线中文字幕| 成人18禁在线播放| 波多野结衣av一区二区av| av福利片在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 成在线人永久免费视频| 亚洲在线自拍视频| 国产不卡一卡二| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久99热这里只有精品18| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 最近在线观看免费完整版| 又紧又爽又黄一区二区| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 少妇的丰满在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 18禁美女被吸乳视频| xxx96com| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲色图av天堂| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 丁香六月欧美| 国产欧美日韩一区二区三| 国产av又大| 岛国在线观看网站| 久久久久久大精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 此物有八面人人有两片| av视频在线观看入口| 久久久久久久久免费视频了| 一本一本综合久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕久久专区| 日韩精品青青久久久久久| 久久亚洲真实| 久久久久国产一级毛片高清牌| 波多野结衣av一区二区av| 久久午夜亚洲精品久久| 久久精品91蜜桃| 久久精品成人免费网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 18禁美女被吸乳视频| 国产免费男女视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产成年人精品一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 久久久久九九精品影院| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美性长视频在线观看| 久久99热这里只有精品18| 俺也久久电影网| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品av久久久久免费| 国产精品 欧美亚洲| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 波多野结衣高清无吗| 一夜夜www| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av第一区精品v没综合| 韩国av一区二区三区四区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲色图av天堂| 一夜夜www| 一二三四在线观看免费中文在| 一本久久中文字幕| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 最近最新免费中文字幕在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美亚洲日本最大视频资源| 听说在线观看完整版免费高清| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品成人免费网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产成人精品久久二区二区免费| 日本免费a在线| 欧美性猛交黑人性爽| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩视频一区二区在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 久久人妻av系列| 亚洲精品美女久久av网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 老司机福利观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美大码av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| a级毛片a级免费在线| 国产高清videossex| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲欧美激情综合另类| 国产野战对白在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 色综合亚洲欧美另类图片| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 久久青草综合色| 18禁国产床啪视频网站| 久久久国产成人精品二区| av欧美777| 日韩欧美国产在线观看| 天堂√8在线中文| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品亚洲美女久久久| 大型av网站在线播放| 成人国语在线视频| 久久99热这里只有精品18| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一个人免费在线观看的高清视频| 757午夜福利合集在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲国产欧美网| 欧美成人性av电影在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 男女视频在线观看网站免费 | АⅤ资源中文在线天堂| 91在线观看av| 亚洲黑人精品在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| aaaaa片日本免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人人澡人人妻人| 国产三级黄色录像| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜影院日韩av| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 俺也久久电影网| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| www.999成人在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 老鸭窝网址在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| av超薄肉色丝袜交足视频| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美一级毛片孕妇| 国产av不卡久久| 国产免费男女视频| 久久精品成人免费网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久国产成人精品二区| 久久久久久久久久黄片| 搡老熟女国产l中国老女人| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久精品人妻少妇| www.精华液| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩国内少妇激情av| 男人操女人黄网站| 美女免费视频网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费无遮挡裸体视频| 欧美日韩一级在线毛片| avwww免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲七黄色美女视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| avwww免费| 男男h啪啪无遮挡| 18美女黄网站色大片免费观看| www.自偷自拍.com| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品日韩av在线免费观看| 白带黄色成豆腐渣| 人人妻人人澡人人看| 欧美黑人精品巨大| 麻豆一二三区av精品| 欧美黑人巨大hd| 丝袜在线中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播 | 一本大道久久a久久精品| 高清毛片免费观看视频网站| 最好的美女福利视频网| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一级毛片女人18水好多| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲中文av在线| 欧美日韩精品网址| 精品欧美国产一区二区三| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 最新在线观看一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 午夜免费鲁丝| 大型av网站在线播放| 97碰自拍视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久久久久久久中文| 制服丝袜大香蕉在线| 天天一区二区日本电影三级| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 老司机午夜十八禁免费视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲成av人片免费观看| 麻豆成人av在线观看| 91成年电影在线观看| 一级毛片女人18水好多| 岛国视频午夜一区免费看| 正在播放国产对白刺激| 一区福利在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 搡老岳熟女国产| 老司机福利观看| 午夜福利欧美成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品一区av在线观看| 黄片播放在线免费| 人成视频在线观看免费观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女那种视频在线观看|