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    梅毒螺旋體對人腦微血管內(nèi)皮細胞趨化因子配體6、8、10表達的影響

    2018-06-13 06:06:50吳凡胡文龍許卜方王千秋
    中華皮膚科雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:螺旋體梅毒培養(yǎng)液

    吳凡 胡文龍 許卜方 王千秋

    210042南京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病防治室(第一作者現(xiàn)在南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院皮膚科,211100)

    最新研究結(jié)果顯示,神經(jīng)梅毒患者腦脊液中多種趨化因子配體(CXCL13、CXCL8、CXCL10等)濃度顯著高于無神經(jīng)梅毒的梅毒患者,且驅(qū)梅治療后濃度恢復(fù)正常,腦脊液中的這些CXCL具有成為診斷神經(jīng)梅毒標(biāo)志物的潛力[1]。CXCL6也被稱為粒細胞趨化蛋白2,具有激活中性粒細胞、誘導(dǎo)T細胞遷徙和促血管生成等作用。Linge等[2]發(fā)現(xiàn)CXCL6自身也具有極高的抗菌活性,可通過附著于細菌表面導(dǎo)致細菌膜破裂。CXCL8即白細胞介素8,是一種促炎細胞因子,在招募中性粒細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的過程中發(fā)揮重要作用,同時CXCL8直接參與中性粒細胞在內(nèi)皮細胞表面的移動[3]。機體中CXCL10表達水平變化與感染、免疫功能異常和腫瘤等誘導(dǎo)的炎癥有關(guān),在多種疾病中,CXCL10被公認為預(yù)測疾病嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[4]。Brissette等[5]報道伯氏螺旋體刺激后人腦微血管內(nèi)皮細胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)中CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL8等多種趨化因子配體表達升高。我們前期研究[6]證實,梅毒螺旋體可以依附于體外培養(yǎng)的HBMEC。本研究中,我們利用新鮮提取的有活性梅毒螺旋體刺激HBMEC,觀察該細胞中CXCL6、CXCL8和CXCL10基因和蛋白表達水平,進一步探討HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病中的作用。

    材料與方法

    一、材料

    1.動物和細胞來源:3月齡成年雄性新西蘭大白兔購自江蘇省金陵種兔場[許可證號:SCXK(蘇)2012-0003,動物合格證號:NO.201602656],體重2.5~3 kg,梅毒螺旋體明膠凝集試驗和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實驗均陰性,按要求飼養(yǎng)于南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心。梅毒螺旋體株(Nichols株)由廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院楊天賜教授饋贈。原代HBMEC來自美國Cell Systems公司,人類急性早幼粒白血病細胞株(HL-60細胞)來自中國科學(xué)院細胞庫。

    2.主要試劑和材料:內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液(美國Cell Systems公司),RPMI 1640培養(yǎng)基、脂多糖、噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),兔血清(自制),TRIzol試劑(美國Invitrogen公司),SYBR green實時熒光定量PCR檢測試劑盒(大連 TaKaRa公司),CXCL6、CXCL8、CXCL10定量ELISA試劑盒(美國R&D公司),Transwell培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

    3.主要儀器:全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司),熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

    二、方法

    1.細胞培養(yǎng):HBMEC和HL-60細胞分別接種于內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液和含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,均置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。HBMEC傳代3~6次后進行實驗。為誘導(dǎo)HL-60細胞分化為類中性粒細胞,向培養(yǎng)液中加入1.5%DMSO刺激5 d。

    2.梅毒螺旋體培養(yǎng)和收集:按文獻[6]培養(yǎng)和收集有毒力的梅毒螺旋體,用內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液稀釋為1.6×107條/ml的梅毒螺旋體懸液。取部分螺旋體懸液于56℃水浴鍋中熱處理30 min制成滅活的梅毒螺旋體懸液。

    3.反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR檢測HBMEC中CXCL6、8、10 mRNA表達水平:將HBMEC按1×106個/孔接種于6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。移去舊培養(yǎng)液,加入新鮮提取的有活性梅毒螺旋體懸液(梅毒螺旋體組)或滅活(滅活梅毒螺旋體組)菌懸液,以含200 μg/L脂多糖為陽性對照組,以只含細胞培養(yǎng)液的孔作為空白對照組,每孔設(shè)置3個復(fù)孔,于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12和24 h。棄舊液,加磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次,每孔加入1 ml TRIzol試劑,反復(fù)吹打,直到液體變成清亮的粉紅色,置于-80℃冰箱中凍存。

    采用氯仿法提取細胞總RNA,檢測RNA純度和濃度后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,置于-80℃冰箱中凍存。運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CXCL6正向引物:5′-CCTGTCTCTGCTGTGCTGAC-3′,反向引物:5′-CACTTCCACCTTGGAGCACT-3′;CXCL8正向引物:5′-CCTGTCTCTGCTGTGCTGAC-3′,反向引物:5′-CACTTCCACCTTGGAGCACT-3′;CXCL10正向引物:5′-GAACTGTACGCTGTACCTGC A-3′,反向引物:5′-TTGATGGCCTTCGATTCTGGA-3′;β肌動蛋白正向引物:5′-CAGGCACCAGGGCGT GATGG-3′,反向引物:5′-CGATGCCGTGCTCGATGG GG-3′。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán)。以β肌動蛋白作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計算目的基因的表達倍數(shù)。

    4.ELISA法檢測HBMEC培養(yǎng)上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10含量:將HBMEC按每孔5×104個接種于96孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h,加入新鮮提取的有活性或滅活梅毒螺旋體懸液刺激HBMEC,以含脂多糖(200 μg/L)的孔作為陽性對照組,以只含細胞培養(yǎng)液的孔為空白對照組,每孔設(shè)置3個復(fù)孔,于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12、24 h,取細胞培養(yǎng)上清液,置-20℃冰箱中凍存。按ELISA試劑盒說明書進行操作,檢測不同處理組HBMEC培養(yǎng)上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10含量。

    5.HL-60細胞遷移實驗:將HBMEC按每孔5×105個接種于24孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h,棄舊培養(yǎng)基,分別加入1.6×107條/ml梅毒螺旋體懸液和滅活菌懸液,以只含細胞培養(yǎng)液的孔為空白對照組,將Transwell小室放入24孔板中,按每孔2×105個將提前誘導(dǎo)的HL-60細胞加入上室中,每孔設(shè)3個復(fù)孔,置于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12和24 h。收集下室中的上清液,150g離心5 min,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞,接種于96孔板中,每孔加入10 μl 0.5%MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),150×g離心10 min,棄上清液,每孔加入100 μl DMSO,置搖床上低速振蕩10 min,用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定各孔A值。

    6.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 17.0軟件進行分析,計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊,進行SNK檢驗;若方差不齊,則進行Games-Howell檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、不同處理組HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10 mRNA表達

    6、12和24 h時各組間CXCL6 mRNA、CXCL8 mRNA、CXCL10 mRNA相對表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。組間比較顯示,在各時間點梅毒螺旋體組中CXCL6、CXCL8和CXCL10 mRNA表達水平均顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P<0.05);梅毒螺旋體組中CXCL6和CXCL8 mRNA表達水平與脂多糖組比較,均P<0.05,而CXCL10 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);滅活梅毒螺旋體組3種基因mRNA表達水平與空白對照組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),與脂多糖組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

    表1 不同處理組中人腦微血管內(nèi)皮細胞趨化因子配體(CXCL)6、CXCL8和CXCL10 mRNA的相對表達水平(±s)

    表1 不同處理組中人腦微血管內(nèi)皮細胞趨化因子配體(CXCL)6、CXCL8和CXCL10 mRNA的相對表達水平(±s)

    注:n=3。a與脂多糖組比較,P<0.05;b與空白對照組比較,P<0.05;c與梅毒螺旋體組比較,P<0.05

    組別CXCL6梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值CXCL8梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值CXCL10梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值6 h 12 h 24 h 5.001±0.322a b1.052±0.012a c7.791±0.936 1.035±0.073 132.073<0.05 13.129±0.554a b1.019±0.073a c14.522±0.958 1.121±0.030 533.007<0.05 8.197±1.020a b0.986±0.041a c21.688±2.652 1.136±0.024 774.608<0.05 7.118±0.908a b1±0.011a c9.393±0.428 1.11±0.109 213.377<0.05 15.898±1.572a b1.076±0.095a c28.063±3.521 1.078±0.095 767.931<0.05 24.261±2.906a b1.053±0.117a c34.583±4.084 1.065±0.118 404.303<0.05 14.436±1.379b1.053±0.024a c13.317±1.247 1.023±0.024 191.272<0.05 17.238±1.993b1.057±0.084a c16.855±3.754 0.997±0.014 239.889<0.05 27.877±3.626b1.020±0.131a c24.867±1.627 1.018±0.012 164.905<0.05

    二、不同處理組HBMEC上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10蛋白含量

    單因素方差分析顯示,在6、12和24 h時4組間CXCL6(F值分別為 229.960、573.247、522.244,均P<0.05)和 CXCL8(F值分別為 268.029、342.715、496.257,均P<0.05)的含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。兩兩比較顯示,梅毒螺旋體組CXCL6和CXCL8含量高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P<0.05),而滅活梅毒螺旋體組CXCL6和CXCL8含量與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

    梅毒螺旋體組CXCL6含量隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,12 h時達最高峰,且各時間點間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=189.540,P<0.05),見圖1A;而CXCL8含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高,各時間點間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=353.578,P<0.05),見圖1B。各時間點梅毒螺旋體組、滅活梅毒螺旋體組和空白對照組間CXCL10差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見圖1C。

    三、各組HL-60細胞遷移情況

    Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示,在6、12和24 h時3組間Transwell小室下室中遷移的HL-60細胞數(shù)量均存在組間差異(F值分別為291.317、131.279、589.958,均P<0.05)。組間比較顯示,在各時間點梅毒螺旋體組Transwell小室下室中遷移的HL-60細胞數(shù)量顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組(均P<0.05);而后2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    討 論

    梅毒螺旋體對CNS有一定的親和性,有研究顯示,梅毒螺旋體感染人體后不久即可出現(xiàn)在腦脊液中,24%未治療的梅毒患者腦脊液中可發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體,一期梅毒患者腦脊液中梅毒螺旋體陽性率高達40%[7]。動物模型[8]和梅毒螺旋體基因分型研究結(jié)果[9-11]均證實存在具有CNS親和性的梅毒螺旋體亞型。血腦屏障作為一個由HBMEC、星形膠質(zhì)形成細胞和周細胞等成分構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu),是CNS抵御病原微生物侵襲的第一道防線。HBMEC作為血腦屏障中最重要的成分,一方面是血腦屏障物理屏障的實質(zhì)成分,另一方面HBMEC受到病原微生物的刺激后會分泌趨化因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)激活宿主的免疫系統(tǒng)[12]。我們利用新鮮提取的具有活性的梅毒螺旋體刺激HBMEC,觀察細胞中CXCL6、CXCL8和CXCL10的變化情況,探討HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病過程中的作用。

    表2 不同處理組人腦微血管內(nèi)皮細胞對HL-60細胞遷移的影響(A570,±s)

    表2 不同處理組人腦微血管內(nèi)皮細胞對HL-60細胞遷移的影響(A570,±s)

    注:n=3。a與空白對照組和滅活梅毒螺旋體組比較,P<0.05

    組別梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組空白對照組F值P值6 h 0.734±0.014a0.518±0.012 0.512±0.011 291.317<0.05 12 h 0.822±0.022a0.556±0.008 0.559±0.028 131.279<0.05 24 h 1.017±0.015a0.528±0.024 0.524±0.020 589.958<0.05

    本研究中,有活性的梅毒螺旋體刺激HBMEC后CXCL6和CXCL8在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平均顯著升高,而滅活的梅毒螺旋體未引起這些變化。值得一提的是,CXCL10 mRNA雖然高表達,但細胞培養(yǎng)上清液中CXCL10的含量與空白對照和滅活梅毒螺旋體組間無明顯差異。這可能與mRNA翻譯和翻譯后調(diào)控有關(guān),具體原因尚需后續(xù)研究深入分析。

    CXCL6、CXCL8和CXCL10是一類對中性粒細胞有趨化和激活作用的細胞因子,因此我們利用Transwell細胞遷移實驗探討梅毒螺旋體刺激后HBMEC對中性粒細胞的吸引能力。HL-60細胞經(jīng)DMSO誘導(dǎo)后可分化為成熟的類中性粒細胞,表達多種中性粒細胞分子標(biāo)志物,同時也具備吞噬能力,是中性粒細胞相關(guān)研究的良好替代模型[13]。我們利用HL-60細胞替代中性粒細胞進行實驗,結(jié)果顯示,有活性的梅毒螺旋體刺激后HBMEC對HL-60細胞的趨化能力明顯增加,而滅活梅毒螺旋體并無該作用。前期研究發(fā)現(xiàn),梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47和Tpp17均可激活人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),通過上調(diào)HUVEC中細胞間黏附分子和E選擇素的表達,增強HUVEC對單核巨噬細胞的趨化和黏附能力[14-15]。鑒于HBMEC與外周血管內(nèi)皮細胞存在較多理化性質(zhì)上的差異,梅毒螺旋體是否可以激活HBMEC從而誘導(dǎo)巨噬細胞趨化,有待進一步實驗驗證。

    綜上所述,有活性的梅毒螺旋體可上調(diào)HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10的基因表達水平,提高CXCL6和CXCL8的分泌水平,同時增強HBMEC對HL-60細胞的趨化能力,這些可能在神經(jīng)梅毒的發(fā)病中起一定作用。本研究存在兩點不足,一方面,僅構(gòu)建了HBMEC的單層血腦屏障細胞模型,未考慮其他血腦屏障組成細胞和基底膜對HBMEC的影響;另一方面,未檢驗遷移來的HL-60細胞是否被激活,是否具有吞噬能力。后續(xù)研究中我們將構(gòu)建雙重或三重血腦屏障細胞模型,進一步探討遷移后的HL-60細胞對梅毒螺旋體的吞噬情況,以更全面和深入地分析HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病中的作用。

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