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    廣東地區(qū)梅毒螺旋體臨床株的分離傳代培養(yǎng)及非同義單核苷酸多態(tài)性檢測

    2018-06-13 06:06:50柯吳堅黃濤張君呂萍薛耀華張曉輝王柳苑劉雅慧鄭和平
    中華皮膚科雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:葡胺螺旋體梅毒

    柯吳堅 黃濤 張君 呂萍 薛耀華 張曉輝 王柳苑 劉雅慧 鄭和平

    510009廣州,南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院

    不同個體感染梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)后臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)各異[1],提示Tp感染過程中可能存在宿主遺傳易感性或Tp基因致病性差異[2]。然而,大量梅毒宿主遺傳易感性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms,SNP)數(shù)據(jù)表明,宿主SNP與Tp遺傳易感性均無顯著相關(guān)[3-5]。因此Tp基因SNP導(dǎo)致的致病性差異將成為未來的研究熱點(diǎn)[2,6]。我們從廣東地區(qū)1例梅毒患者皮損中分離Tp臨床株(命名為廣東1株,簡稱GD1株),在兔睪丸中連續(xù)傳代培養(yǎng),通過目的基因DNA片段測序分析廣東地區(qū)Tp基因編碼區(qū)非同義SNP(non-synonymous SNP,nsSNP)位點(diǎn)突變,為后續(xù)GD1株全基因組測序奠定研究基礎(chǔ)。

    一、對象與方法

    1.對象:患者為30歲男性,因陰莖無痛性潰瘍9 d就診。體檢:陰莖表面多個淺表無痛性潰瘍,伴雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室檢查:潰瘍分泌物暗視野顯微鏡檢查陰性,甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)陰性,梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)陽性。7 d后復(fù)查潰瘍暗視野顯微鏡檢查陰性,TRUST陰性,TPPA 1∶160陽性。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批件號:GDDHLS-20170610),患者簽署知情同意書。

    2.GD1株的分離和傳代培養(yǎng):輕擠患者硬下疳皮損,用無針頭5 ml注射器收集皮損中的漿液性滲出液,加入到含20%非感染兔血清中,立刻接種于3月齡、體重約3 kg、經(jīng)梅毒螺旋體免疫熒光抗體試驗(yàn)(FTA)和性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)(VDRL)雙重驗(yàn)證排除Tp感染的成年新西蘭白兔雙側(cè)睪丸內(nèi),每個睪丸接種1 ml。待形成睪丸炎后,兔子處予安樂死,手術(shù)取睪丸,制備成菌懸液,采用暗視野顯微鏡、TP0548 PCR、測序和基因分型多重驗(yàn)證是否傳代成功。取6 ml GD1菌懸液再次傳代于3只新西蘭白兔睪丸,剩余菌懸液采用500×g低速離心10 min,分離兔睪丸組織,吸取上清液后20 000×g離心30 min,去上清液,保留約0.2 ml濃縮GD1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)以上步驟,直到獲得足夠?qū)嶒?yàn)GD1菌液。實(shí)驗(yàn)動物購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:44002100005265)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院動物管理及使用委員會批準(zhǔn),并參照實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南進(jìn)行操作。

    3.TP0548基因PCR、測序和分型:應(yīng)用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國QIAGEN公司)提取GD1菌懸液DNA,以Nichols標(biāo)準(zhǔn)株(美國華盛頓大學(xué)Sheila Lukehart教授饋贈)DNA為陽性對照,以分子水(molecular H2O,mH2O,美國Sigma公司)為陰性對照。PCR體系50 μl,模板DNA 5 μl、2.5 mmol/L dNTPs(美國Thermo公司)4 μl、10 × Go Taq PCR緩沖液(美國 Promega公司)5 μl、25 mmol/L MgCl2(美國Sigma公司)3 μl、20 μmol/L引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1]0.5 μl、5 U熱啟動Taq PCR聚合酶(美國Promega公司)0.5 μl、mH2O 31.5 μl。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性1 min、60℃退火2 min、72℃延伸1 min,共45個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,結(jié)果經(jīng)BLAST驗(yàn)證。TP0548基因分型和nsSNPs分別采用BioEdit多重和雙重序列比對分析。

    4.泛影葡胺密度梯度離心法[7]純化GD1株:將60%泛影葡胺(上?;春V扑帍S)稀釋成37.5%、25.0%、19.0%,于硝酸纖維管中依次加入1.5 ml 60%泛影葡胺、1 ml 37.5%泛影葡胺、1 ml 25.0%泛影葡胺和1 ml 19.0%泛影葡胺,最終形成非連續(xù)梯度。將步驟2獲得的濃縮GD1株置于泛影葡胺非連續(xù)梯度離心液上層,20℃100 000×g離心45 min。離心后,在60%和37.5%泛影葡胺之間、37.5%和25.0%之間、25.0%和19.0%之間出現(xiàn)3條乳白色條帶。選取菌量多的條帶進(jìn)行nsSNP檢測。

    5.TP0574 qPCR定量檢測各層GD1株菌量[8-9]:參照步驟3分別提取各條帶內(nèi)GD1株基因組DNA。用LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green試劑盒(瑞士羅氏公司)檢測各條帶的GD1菌量,以Nichols標(biāo)準(zhǔn)株DNA為陽性對照,以mH2O為陰性對照,已知濃度的TP0574質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參。PCR總反應(yīng)體系為20 μl:5 μl待檢測DNA樣本、2 μl 20 μmol/L TP0574引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1]、4 μl 5 × Master Mix(瑞士羅氏公司)、9 μl mH2O。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性10 s、60℃退火8 s、72℃延伸13 s,共45個循環(huán);最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物用LightCycler software(美國羅氏公司)分析。

    6.PCR擴(kuò)增TP0443和TP0584 nsSNPs:取純化后的GD1株DNA作為模板,以Nichols株DNA為陽性對照,以mH2O為陰性對照,常規(guī)PCR擴(kuò)增TP0443和TP0584 nsSNPs,引物序列見表1。50 μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑和擴(kuò)增條件參照步驟3。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    二、結(jié)果

    1.分離培養(yǎng)出GD1株:從梅毒患者硬下疳皮損分離到的Tp接種至新西蘭白兔睪丸,約1個月形成睪丸炎,取睪丸制備菌懸液,經(jīng)暗視野顯微鏡檢查可見Tp(圖1),表明成功從硬下疳分離出具有傳染活性的臨床Tp。

    2.TP0548基因PCR、測序和分型結(jié)果:GD1菌懸液DNA經(jīng)TP0548 PCR擴(kuò)增,于361 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶(圖2)。經(jīng)BLAST比對,確認(rèn)為TP0548片段;經(jīng)BioEdit多重序列比對,為TP0548分型中的f亞型。

    3.TP0574 qPCR定量檢測各層GD1株菌液濃度:以TP0574質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)參,qPCR定量檢測各層GD1菌液濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GD1株菌液在19.0%和25.0%層以及25.0%和37.5%層的濃度明顯高于37.5%和60%層。

    4.GD1株TP0443和TP0584 PCR和nsSNPs測序結(jié)果:GD1菌懸液DNA經(jīng)TP0443和TP0584 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為328 bp和301 bp(圖3)。將GD1株測序結(jié)果與美國Nichols標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行nsSNPs位點(diǎn)比對,GD1株第469810位堿基由A突變?yōu)镚(圖4A),對應(yīng)第120位編碼氨基酸由蘇氨酸→丙氨酸,導(dǎo)致TP0443基因出現(xiàn)nsSNP位點(diǎn)突變;634785位堿基由G突變?yōu)锳(圖4B),對應(yīng)第314位編碼氨基酸由丙氨酸→蘇氨酸,導(dǎo)致TP0584基因出現(xiàn)nsSNP位點(diǎn)突變。

    表1 梅毒螺旋體基因和非同義單核苷酸多態(tài)引物序列[7-9]

    三、討論

    圖1 梅毒螺旋體暗視野顯微鏡圖(×40) 圖2 梅毒螺旋體TP0548基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 1:TP0548基因;2:陽性對照;3:陰性對照;4:標(biāo)準(zhǔn)參照物

    圖3 梅毒螺旋體臨床株與Nichils株TP0443和TP0584基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 1:Nichils株TP0443基因;2:臨床株TP0443基因;3:Nichils株TP0584基因;4:臨床株TP0584基因;5:TP0443陰性對照;6:TP0584陰性對照;7:標(biāo)準(zhǔn)參照物

    圖4 梅毒螺旋體臨床株TP0443、TP0584基因部分序列圖4A:箭頭所示為TP0443堿基發(fā)生A→G突變;4B:箭頭所示為TP0584堿基發(fā)生G→A突變

    Tong等[10]通過對廈門地區(qū)分離出的Amoy株進(jìn)行全基因組序列分析發(fā)現(xiàn),Amoy株與Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、SS14、Mexico A、DAL-1和Chicago存在良好的基因組共線性關(guān)系,Amoy株與SS14高度同源。Sun等[11]通過比較6株上海地區(qū)、1株山西地區(qū)和1株安徽地區(qū)分離的Tp全基因組發(fā)現(xiàn),8個菌株間存在329個SNPs,其中有5個為青霉素結(jié)合蛋白nsSNPs位點(diǎn)。廣東地區(qū)梅毒菌株是否存在nsSNPs目前仍未知。本實(shí)驗(yàn)用泛影葡胺密度梯度離心法成功地從新西蘭白兔睪丸組織中分離、純化并獲得高純度的GD1株。通過比對GenBank中Nichols標(biāo)準(zhǔn)株與全球不同地區(qū)的11株臨床分離株(DAL-1、SS14、Chicago、Mexico A、Sea81-4、UW074B、UW189B、UW228B、UW254B、UW391B和Amoy)全基因序列,共篩選出2個nsSNPs位點(diǎn)。nsSNPs檢測結(jié)果證實(shí),GD1株與美國Nichols株存在nsSNPs突變,該基因突變導(dǎo)致TP0443和TP0584的氨基酸序列出現(xiàn)改變。

    國內(nèi)外Tp菌株間的nsSNPs差異除了可用于Tp分子流行病學(xué)、傳播機(jī)制和傳播效應(yīng)的研究,還為后續(xù)nsSNPs致病性差異比較、研究發(fā)病機(jī)制和Tp全基因組測序奠定基礎(chǔ)。

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