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    penA和mtrR基因突變?cè)隗w外誘導(dǎo)淋球菌對(duì)頭孢曲松耐藥作用的研究

    2018-06-13 06:06:50其木格董磊張秀麗張立忠李艷飛王杰
    中華皮膚科雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:淋球菌頭孢曲松敏感性

    其木格 董磊 張秀麗 張立忠 李艷飛 王杰

    010017呼和浩特,內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科(其木格、張秀麗、張立忠、李艷飛、王杰);內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生院[董磊(現(xiàn)在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科)]

    頭孢曲松是治療淋病的一線藥物,但近年來(lái)對(duì)頭孢曲松敏感性下降或耐藥的淋球菌在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)出現(xiàn)[1-3],亦有數(shù)個(gè)頭孢曲松治療咽部淋球菌感染失敗的報(bào)道[4-5]。我國(guó)目前尚無(wú)頭孢曲松耐藥相關(guān)的淋病治療失敗報(bào)道,但頭孢曲松低敏的淋球菌陽(yáng)性率逐年升高[6-7]。淋球菌對(duì)頭孢菌素低敏或耐藥的分子機(jī)制涉及青霉素結(jié)合蛋白2基因(penA)、調(diào)節(jié)MtrCDE外排泵功能的基因(mtrR)、孔蛋白基因(porB/penB)、青霉素結(jié)合蛋白1基因(ponA)以及pilQ基因等在內(nèi)的多個(gè)耐藥基因決定子以及其他未知的耐藥基因,其中編碼青霉素結(jié)合蛋白2(PBP2)轉(zhuǎn)肽酶的penA基因突變起主導(dǎo)作用[8]。為進(jìn)一步探討penA和mtrR基因突變?cè)诹芮蚓鷮?duì)頭孢曲松耐藥機(jī)制中的作用,我們通過(guò)對(duì)原代及子代耐藥淋球菌株penA和mtrR基因測(cè)序,了解靶位基因突變與菌株耐藥的關(guān)系。

    一、材料與方法

    1.菌株來(lái)源:所用4株淋球菌均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病實(shí)驗(yàn)室提供,體外次抑菌濃度誘導(dǎo)頭孢曲松耐藥過(guò)程亦在該實(shí)驗(yàn)室完成。1株為標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-49226(頭孢曲松敏感菌株),3株為臨床分離株,分別為頭孢曲松低敏菌株(2012-5616)、頭孢曲松敏感菌株(2012-4052和2012-15361)。4株菌均經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)確認(rèn),藥物敏感性試驗(yàn)已在前期完成[9],菌株的藥物敏感性特征見(jiàn)表1。

    2.主要試劑:頭孢曲松鈉標(biāo)準(zhǔn)粉為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,淋球菌培養(yǎng)基GC基礎(chǔ)粉和增菌劑(1%IsoVitaleX)均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品,淋球菌氧化酶、DNA提取液、PCR試劑、引物等由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,基因測(cè)序由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

    3.體外次抑菌濃度誘導(dǎo)試驗(yàn):將選取的4株試驗(yàn)菌株進(jìn)行頭孢曲松體外次抑菌濃度(1/2最低抑菌濃度,1/2 MIC)誘導(dǎo),在36℃、5%CO2及80%濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h時(shí)于抗生素培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種傳代1次,待菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定后,連續(xù)傳代培養(yǎng),MIC濃度依次遞增為1/2、1、2、4、8、16……直至最后1次的培養(yǎng)基上有菌落穩(wěn)定生長(zhǎng)(MIC≥1 mg/L)。在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中繼續(xù)傳代培養(yǎng)耐藥突變菌株,研磨洗脫于20%甘油的胰酶大豆肉湯凍存培養(yǎng)基中,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    4.penA和mtrR基因引物:采用Lee等[10]設(shè)計(jì)的引物,penA基因片段較長(zhǎng),將其分成3個(gè)片段penA-1、penA-2和penA-3,測(cè)序后再用基因軟件DNAStar進(jìn)行拼接分析。引物序列見(jiàn)表2。

    5.penA和mtrR基因測(cè)序:提取誘導(dǎo)前原代菌株及誘導(dǎo)后子代耐藥菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)總體系50 μl,其中緩沖液5 μl,dNTP 1 μl,正反向引物各1 μl,DNA模板1 μl,DNA聚合酶(Taq酶)0.3 μl,雙蒸水 41 μl;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 s,94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。之后將ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后的原代和子代耐藥株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序。

    表1 研究所用4株淋球菌菌株的藥物敏感性

    表2 penA和mtrR基因引物序列

    二、結(jié)果

    1.4株耐藥淋球菌的PCR結(jié)果:ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后均有目的基因表達(dá),penA基因分段擴(kuò)增出的陽(yáng)性片段長(zhǎng)度分別為620、580和870 bp,mtrR基因?yàn)?00 bp。見(jiàn)圖1。

    2.體外次抑菌濃度誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果:ATCC-49226從1/2 MIC誘導(dǎo)至64 MIC產(chǎn)生耐藥共誘導(dǎo)了28代,臨床低敏菌株2012-5616誘導(dǎo)至4 MIC共傳代了26代,臨床敏感菌株2012-15361誘導(dǎo)至16 MIC共傳代了36代,臨床敏感菌株2012-4052誘導(dǎo)至16 MIC共傳代了22代。見(jiàn)表3。

    圖 1 淋球菌株 ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361誘導(dǎo)耐藥前后penA和mtrR基因凝膠電泳圖 -:陰性對(duì)照;M:標(biāo)準(zhǔn)參照物

    3.基因測(cè)序結(jié)果:

    (1)penA基因測(cè)序結(jié)果:ATCC-49226誘導(dǎo)耐藥前PBP2序列為標(biāo)準(zhǔn)序列,2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導(dǎo)前后以及ATCC-49226誘導(dǎo)后耐藥菌株的PBP2序列都是ⅩⅧ序列(含A501T和G542S);ATCC-49226誘導(dǎo)耐藥后在penA編碼區(qū)發(fā)生A501T、G542S突變,另3株菌誘導(dǎo)后penA基因均未出現(xiàn)新的突變位點(diǎn);未檢測(cè)到penA鑲嵌狀結(jié)構(gòu)模式。penA基因測(cè)序獲得的波形圖符合標(biāo)準(zhǔn)基因測(cè)序分析的要求。見(jiàn)圖2。

    (2)mtrR基因測(cè)序結(jié)果:2012-5616和ATCC-49226菌株在誘導(dǎo)前后均為A39T突變模式,2012-15361菌株誘導(dǎo)前后均無(wú)突變,2012-4052誘導(dǎo)后耐藥菌株在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變。

    三、討論

    淋球菌對(duì)頭孢曲松耐藥涉及多個(gè)耐藥基因決定子及其相互作用,包括penA基因、mtrR基因等[8]。penA的鑲嵌狀突變模式和非鑲嵌狀penA的A501位的突變被證實(shí)與頭孢曲松的耐藥相關(guān)[11-13]。mtrR基因表達(dá)主要與淋球菌外排系統(tǒng)有關(guān),發(fā)生突變時(shí)可以導(dǎo)致mtrCDE外排泵系統(tǒng)表達(dá)增加,使淋球菌內(nèi)部有效藥物濃度下降而引起耐藥[14]。

    Unemo等[15]研究臨床分離的高度耐頭孢曲松淋球菌菌株H401,發(fā)現(xiàn)含有penA-CI鑲嵌狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)同時(shí)合并PBP2發(fā)生A501P突變,可能引起淋球菌對(duì)頭孢曲松敏感性下降。Sethi等[16]對(duì)大樣本臨床敏感淋球菌進(jìn)行MIC檢測(cè)及penA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),所有敏感菌株未發(fā)現(xiàn)鑲嵌狀結(jié)構(gòu)及PBP2的A501突變,從而認(rèn)為鑲嵌狀結(jié)構(gòu)或PBP2的A501突變可能只發(fā)生在淋球菌對(duì)頭孢曲松低敏或耐藥的菌株。Lee等[10]對(duì)46株頭孢克肟和頭孢曲松敏感性降低的淋球菌進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),頭孢菌素敏感性降低的大多數(shù)菌株,penA突變模式以A501V突變?yōu)橹?。Olsen等[17]對(duì)2011年越南地區(qū)收集的淋球菌進(jìn)行藥敏及耐藥基因研究顯示,78%的淋球菌PBP2的A501位氨基酸出現(xiàn)突變,其中A501V突變模式占44%,A501T突變模式占34%。還有研究發(fā)現(xiàn),A501突變和G542S與非鑲嵌狀PBP2菌株的頭孢曲松耐藥或敏感性下降有關(guān)[18-20]。我們的研究中,頭孢曲松敏感菌株誘導(dǎo)耐藥后出現(xiàn)A501T和G542S突變,提示penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用。

    Liao等[21]對(duì)淋球菌臨床敏感菌株及低敏菌株研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)mtrR基因編碼區(qū)特定位點(diǎn)突變(如A39T、G45D)和(或)啟動(dòng)子區(qū)的13 bp反向重復(fù)序列的單堿基A缺失突變時(shí),MtrR蛋白減少,引起MtrCDE外排泵系統(tǒng)過(guò)度表達(dá),增加藥物外排,從而導(dǎo)致包括頭孢曲松在內(nèi)的抗生素敏感性下降。我們的研究中,菌株2012-5616(頭孢曲松低敏并對(duì)青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素和環(huán)丙沙星耐藥)和ATCC-49226(頭孢曲松和環(huán)丙沙星敏感,但對(duì)青霉素、四環(huán)素和阿奇霉素低敏)在誘導(dǎo)前已出現(xiàn)A39T突變;而菌株2012-4052(頭孢曲松敏感,對(duì)四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥,對(duì)青霉素和阿奇霉素低敏)只在誘導(dǎo)耐藥后在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變。這些結(jié)果提示,在mtrR編碼區(qū)發(fā)生A39T突變可能在頭孢曲松耐藥中發(fā)揮作用,另外,mtrR基因可能與多重耐藥相關(guān)。

    表3 4株淋球菌誘導(dǎo)耐藥前后頭孢曲松最低抑菌濃度(MIC)變化情況

    圖2 penA基因片段測(cè)序波形圖

    本研究中penA、mtrR基因主要是針對(duì)體外誘導(dǎo)頭孢曲松耐藥菌株進(jìn)行的研究,很遺憾未能進(jìn)行臨床分離頭孢曲松耐藥菌株的基因突變的研究。

    綜上所述,penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用;而mtrR基因發(fā)生A39T突變的作用有待于進(jìn)一步研究。

    志謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病科蘇曉紅教授及性病實(shí)驗(yàn)室樂(lè)文靜、李賽等

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