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      大鼠乳腺增生模型造模要素及中醫(yī)藥防治數(shù)據(jù)挖掘研究

      2018-06-13 10:28:00梁源胡鳳嬌王張孫位軍
      中藥與臨床 2018年2期
      關(guān)鍵詞:雌酚腺泡己烯

      梁源,胡鳳嬌,王張,孫位軍

      乳腺增生常見于25-40歲的中青年婦女[1],隨著生活節(jié)奏加快、社會(huì)壓力增大及受生育率下降的影響,其發(fā)病率逐年增高且占乳房疾病的75%[2]。由不良精神刺激等因素引發(fā),導(dǎo)致內(nèi)分泌功能紊亂,雌孕激素比例失衡[3]。在藥物治療上,最常用他莫昔芬,但副作用大,長期服用易致月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)等不良反應(yīng)。與西藥相比,中藥能從多方面、多層次作用于乳腺及肝脾腎組織且安全性較高。

      目前乳腺增生造模方法多樣,但各文獻(xiàn)報(bào)道的造模注射部位、周期、劑量及成功率參差不齊,又因造模耗時(shí)長,故模型復(fù)制效率不高。故本文對(duì)國內(nèi)20多年來應(yīng)用雌性大鼠制造乳腺增生模型的造模要素及其中醫(yī)藥防治的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析,可精準(zhǔn)把握造模要素,提高造模的成功率,對(duì)乳腺增生的有效性評(píng)價(jià)具有一定的參考和指導(dǎo)價(jià)值。

      1 材料

      在中國知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施工程(CNKI)中,以大鼠和乳腺增生為關(guān)鍵詞,收集1989年-2016年期間(27年)的相關(guān)文獻(xiàn)202篇。

      2 方法

      2.1 信息錄入

      應(yīng)用Excel軟件,錄入文章題目、造模情況(造模工具藥名稱、給予天數(shù)、注射劑量及部位、評(píng)價(jià)指標(biāo))、陽性對(duì)照藥、受試藥物情況(藥物名稱、給藥時(shí)間、作用機(jī)制指標(biāo))等信息。

      2.2 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

      制作《大鼠乳腺增生模型的造模要素挖掘數(shù)據(jù)表》。

      2.3 統(tǒng)計(jì)和分析

      對(duì)錄入的每項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,定量歸納造模要素。

      3 結(jié)果

      3.1 動(dòng)物

      SD或Wistar雌性未孕大鼠,SPF級(jí),體重200±22 g,9-11周齡。

      3.2 造模

      3.2.1 造模參數(shù) 詳見表1。造模試劑:常見的有苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚注射液聯(lián)合黃體酮、雌三醇、雌三醇聯(lián)合四氯化碳、己烯雌酚注射液、戊酸雌二醇、摘除兩側(cè)卵巢后注射苯甲酸雌二醇,導(dǎo)致動(dòng)物內(nèi)分泌功能紊亂,雌孕激素比例失衡,亦有用束縛和強(qiáng)迫游泳方法模擬中醫(yī)所謂“肝郁氣滯”病機(jī),亦有造模試劑和強(qiáng)迫游泳同時(shí)使用的方法。其中以苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮最常使用,該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好,其次是苯甲酸雌二醇(單用),再次是己烯雌酚注射液聯(lián)合黃體酮。

      注射劑量:苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮的注射劑量配比最常見為0.5 mg·kg-1+4 mg·kg-1,其次為0.5 mg·kg-1+5 mg·kg-1;苯甲酸雌二醇(單用)注射劑量最常見為0.5 mg·kg-1;己烯雌酚注射液聯(lián)合黃體酮的注射劑量配比最常見為0.5 mg·kg-1+4 mg·kg-1。

      造模天數(shù):造模時(shí)間都比較長(30±9天)。苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮的造模方式是先注射苯甲酸雌二醇,其后注射黃體酮,最常見的時(shí)間組合分別為25 d+5 d,其次為20 d+5 d;苯甲酸雌二醇(單用)最常見的時(shí)間為30d;己烯雌酚注射液聯(lián)合黃體酮最常見的時(shí)間組合為25 d+5 d。

      造模次數(shù):最常見為1次/天注射造模;其次為1次/2天。

      表1 造模參數(shù)統(tǒng)計(jì)表

      0.3 mg·kg-1 (3) 28 d(5)0.8 mg·kg-1 (3) 20 d(4)0.6 mg·kg-1 (2) 21 d(1) 1次/d(10)10 mg·kg-1 (1) 22 d(1)0.05 mg·kg-1(1) 42 d(1) 1次/2 d(1)0.1 mg·kg-1 (1) 49 d(1)文獻(xiàn)未寫明(1) 60 d(1)己烯雌酚注射液聯(lián)合黃體酮(8) 己烯雌酚0.5 mg·kg-1 (8)黃體酮4 mg·kg-1 (8) 己烯雌酚25 d(8) 黃體酮5 d(8) 1次/d(8)雌三醇(1) 1 mg·kg-1 (1) 30 d(1) 1次/2 d(1)雌三醇聯(lián)合四氯化碳(1) 雌三醇0.1/只(1) 四氯化碳0.005 mL·g-1(1) 雌三醇2次/d 28 d(1) 四氯化碳1次/7 d己烯雌酚注射液(1) 20 mg·kg-1 (1) 20 d(1) 1次/2 d(1)戊酸雌二醇(1) 0.4 mg·kg-1 (1) 20 d(1) 1次/2 d(1)摘除兩側(cè)卵巢后注射苯甲酸雌二醇(1) 0.3 mg·kg-1 (1) 15 d(1) 1次/d(1)不定時(shí)強(qiáng)迫游泳5min后注射苯甲酸雌二醇、不定時(shí)強(qiáng)迫游泳5min后注射黃體酮(1)苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1 (1)黃體酮0.5 mg·kg-1 (1)苯甲酸雌二醇21 d(1)黃體酮5 d(1) 1次/d(1)連續(xù)、不定時(shí)的強(qiáng)迫游泳5-10 min(1) —— 30 d(1) 5次/6 d(1)束縛和強(qiáng)迫游泳(1) —— 30 d(1) 1次/d(1)

      3.2.2 注射方式 包括肌肉注射(154篇,占比77.4%)、腹腔注射(35篇,占比17.6%)和皮下注射(10篇,占比5.0%)。

      3.2.3 血清中指標(biāo) 詳見表2。造模后血清中的E2、PRL、FSH上升,P、T下降,LH無顯著性變化。MDA、VEGF、bFGF、ACTH、TC、TG、CORT、LDL-C、ER、PR、p53、Oct4、GnRH、5-HT、aFas、TNF-a均上升,SOD、CD3+、CD4+、CD8+、IL-2、TAC均下降,HDL-C、T3、T4無顯著性變化。當(dāng)體內(nèi)雌激素水平絕對(duì)或相對(duì)增加,孕激素水平呈絕對(duì)或相對(duì)減少時(shí),乳腺受到雌激素的長期刺激,導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管和小葉增生,同時(shí)促進(jìn)組織水、鈉潴留,進(jìn)一步引起小葉間質(zhì)水腫[4]且乳腺實(shí)質(zhì)由于缺乏孕激素的調(diào)節(jié)和保護(hù)而增生過度和復(fù)舊不全,從而引起乳腺導(dǎo)管上皮和纖維組織不同程度的增生和末梢腺管或腺泡形成囊腫,該病的發(fā)生即是以這種增生和復(fù)舊的紊亂為基礎(chǔ)的[5]。有研究顯示,VEGF和bFGF被認(rèn)為是乳腺癌特異性最強(qiáng)的兩種血管因子,且在炎性乳腺癌細(xì)胞中VEGF和COX-2的表達(dá)顯著高于正常乳腺細(xì)胞[6~7]。

      表2 大鼠乳腺增生模型血清中測試指標(biāo)及其變化情況

      注:↓、↑、-分別表示明顯下降、明顯上升、無明顯變化,后同。

      3.2.4 乳腺組織指標(biāo) 詳見表3-7?;贓lisa、IHC(免疫組化)、Western blot和RT-PCR等方法的研究結(jié)果表明,E2、ER、PR、VEGF、bFGF、ERα、PCNA、MTS、collagen-Ⅰ、α-SMA、fibronectin、FasL、ERK、eNOS、GnRH、GnRH-R、bax、NFkB-p65、COX-2、AR、C-erbB-2、PGR、PRLR、PCNA、JNK、AKT、p53、Oct4、AP-2α、TGF-β1、miR-21端粒酶均上升,F(xiàn)as、miR-29a/b均下降,F(xiàn)Ⅷ無明顯變化。ER、PR的過量表達(dá)可使乳腺增生、乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展加劇,ER信號(hào)對(duì)乳腺的生長、發(fā)育及細(xì)胞凋亡有調(diào)控效應(yīng)的作用[8~9]。

      表3 乳腺增生動(dòng)物模型乳腺組織中測試的指標(biāo)(Elisa法)

      表4 乳腺增生動(dòng)物模型乳腺組織中測試的指標(biāo)(IHC法)

      Ⅰ型膠原 collagen-Ⅰ ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 α-SMA ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0纖維連接蛋白 fibronectin ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0上皮細(xì)胞鈣粘蛋白 E-cadherin ↓ 1 ↑ 0 - 0 ↓ 0 ↑ 1 - 0-Fas ↓1↑0-0↓0↑1-0-FasL ↓0↑1-0↓1↑0-0細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 ERK ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0內(nèi)皮型一氧化氮合酶 eNOS ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0促性腺激素釋放激素受體 GnRHR ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0-FⅧ ↓0↑0- 1↓0↑0- 0細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子 bax ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0-NFkB-p65↓0↑1-0↓1↑0-0環(huán)氧合酶-2 COX-2 ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0雄激素受體 AR ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0-C-erbB-2↓0↑1-0↓1↑0-0

      表5 乳腺增生動(dòng)物模型乳腺組織中測試的指標(biāo)(Western blot法)

      表6 乳腺增生動(dòng)物模型乳腺組織中測試的指標(biāo)(原位雜交法)

      表7 乳腺增生動(dòng)物模型乳腺組織中測試的指標(biāo)(熒光定量PCR法)

      轉(zhuǎn)化生長因子-β1 TGF-β1 ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0-miR-21↓0↑1-0↓1↑0-0-miR-29a/b↓1↑0-0↓0↑1-0促性腺激素釋放激素 GnRH ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0促性腺激素釋放激素受體 GnRHR ↓ 0 ↑ 1 - 0 ↓ 1 ↑ 0 - 0

      3.2.5 乳腺組織的病理變化 乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張伴微囊形成且分枝增多,導(dǎo)管壁略有增厚,周圍纖維組織增生明顯,細(xì)胞較為活躍,間質(zhì)有少量以小淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤,管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞及大量分泌物,上皮細(xì)胞多層,皮膚基底細(xì)胞增生成團(tuán)塊狀;乳腺小葉單位數(shù)目增多密集,小葉形態(tài)欠規(guī)則,葉內(nèi)腺泡增多;腺泡大小不等,數(shù)目增多,形態(tài)不規(guī)則,甚至變形,部分結(jié)構(gòu)混亂,可見融合傾向,上皮細(xì)胞呈高柱狀形成復(fù)層或乳頭狀突起,排列比較疏松,大小變化明顯,局灶性實(shí)性巢狀增生,腺泡內(nèi)有粉色滲出物,腺泡間結(jié)締組織減少,以至于腺體呈“背靠背”現(xiàn)象。小葉和腺泡間質(zhì)纖維組織增多。也可根據(jù)導(dǎo)管、腺泡和小葉的病變程度進(jìn)行分級(jí),以期定量參考。

      3.2.6 觀察指標(biāo)

      3.2.3.1 乳頭形態(tài)學(xué)變化 肉眼觀察大多數(shù)大鼠乳房直徑和乳頭高度均增大,乳頭接近大米粒大小且突出皮毛,脫毛后可見紅腫,顏色暗紅,觸之較硬且堅(jiān)挺,部分伴有乳暈形成。

      3.2.3.2 大鼠行為學(xué)變化 大鼠豎毛,皮毛欠光澤,脫毛、精神不振、易激惹,反應(yīng)遲鈍,食量減少或亢進(jìn),糞便時(shí)稀軟,身體嚴(yán)重消瘦或體重增長迅速,進(jìn)食、排便、活動(dòng)減少或增加。神情癡呆,郁郁寡歡。

      3.2.7 其他指標(biāo) 臟器系數(shù)(胸腺、脾臟、子宮和卵巢)和血液流變學(xué)。

      3.3 藥物防治

      3.3.1 給藥方案 采用治療性給藥的方式(136篇,占比64.59%),即造模完成后再給藥治療;預(yù)防性給藥的方式(59篇,占比28.23%)包括造模同時(shí)給藥(44篇,占比21.05%)和造模中期給藥(15篇,占比7.18%)。給藥方式為灌胃給藥,給藥周期為29±13天,與臨床長期給藥的情況類似。

      3.3.2 陽性對(duì)照藥主要為他莫昔芬,中藥制劑主要有乳癖消、乳康片、乳增寧等。他莫昔芬是一種非甾體類的抗雌激素藥物,其作用機(jī)制為與E2競爭靶細(xì)胞(ER),形成穩(wěn)定復(fù)合物,降低E2與靶細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)而降低E2的生物學(xué)效應(yīng)[10~11]。西藥起效快、效果穩(wěn)定,但不良反應(yīng)多。中藥見效緩慢,作用機(jī)制不清但安全性高。

      3.3.3中藥復(fù)方 202篇文章中使用中藥復(fù)方150個(gè),如健乳寧[12]、復(fù)方美登木片[13]、回乳抑增一號(hào)[14]、乳結(jié)平膠囊[15]、西黃丸[16]、消瘀通絡(luò)散[17]、M-Ⅰ號(hào)[9]、桂枝茯苓膠囊[18]、回陽玉龍膏[19]和抗乳增片[20]等。

      3.3.4 常用中藥材 150個(gè)中藥復(fù)方中共涉及中藥材170種,常見者依次為(括號(hào)內(nèi)為使用頻率)柴胡(31.03%),當(dāng)歸(28.08%),香附(2 4.6 3%),丹參(1 5.2 7%),白芍(14.78%),鹿角(13.79%),郁金(12.81%),延胡索(11.33%),夏枯草(10.84%),浙貝母(10.84%),莪術(shù)(10.34%),茯苓(10.34%),青皮(9.85%)等。

      3.3.5 有效性評(píng)價(jià)指標(biāo) 經(jīng)藥物干預(yù)后,血清中E2、PRL、FSH、MDA、VEGF、bFGF、ACTH、TC、TG、CORT、LDL-C、ER、PR、p53、Oct4、GnRH、5-HT、T3等均下降,P、T、SOD、CD3+、CD4+、CD8+、sFas等均升高,LH、FSH、HDL-C、T4無明顯變化。均有利于防治乳腺增生的形成。

      3.3.6 乳腺組織病理學(xué) 經(jīng)藥物干預(yù)后,大多數(shù)乳腺導(dǎo)管細(xì)長且分枝少,腔內(nèi)殘留少許分泌物,上皮細(xì)胞呈立方形且層數(shù)減少,管腔擴(kuò)張減輕。小葉數(shù)量及結(jié)節(jié)減少,體積減小。腺泡恢復(fù)正常且數(shù)量減少,直徑、體積減小,分布均勻,腺泡擴(kuò)張被明顯壓制,腺腔內(nèi)有少量或無分泌現(xiàn)象,上皮細(xì)胞為單層立方上皮。間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生明顯減輕。部分可接近正常的乳腺腺泡結(jié)構(gòu)。

      3.3.7 作用機(jī)制指標(biāo) 經(jīng)藥物干預(yù)后,乳腺組織中ER、ERα、PR、AR、VEGF、bFGF、p16、p53、Oct4、FasL、端粒酶、ERK、eNOS、GnRH、GnRHR、bax、NFkB-p65、COX-2、C-erbB-2、AP-2α、TGF-β1、miR-21等均下降,F(xiàn)as、miR-29a/b等均上升。

      4 討論

      現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,乳腺增生與內(nèi)分泌紊亂、卵巢功能失調(diào)及血管內(nèi)皮因子有關(guān),其發(fā)病機(jī)制可能為通過神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)綜合調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸和下丘腦-垂體-腎上腺軸[21]。評(píng)價(jià)指標(biāo)主要涵蓋內(nèi)分泌激素、肝脾腎功能及各類因子等方面,因此,治療乳腺增生病的關(guān)鍵是恢復(fù)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的正常功能,防止乳腺增生。

      中醫(yī)則從肝脾腎論治乳腺增生癥。乳腺增生屬于“乳癖”、“乳中結(jié)核”范疇且與精神因素有關(guān)。本病發(fā)病之本為肝、脾、腎不足,表現(xiàn)為肝郁氣滯而血行不暢、沖任失調(diào)、肝腎不足及思慮傷脾而痰濁內(nèi)生互阻傷乳絡(luò)[14,22]。王雪壓[23]的乳核散結(jié)湯是依據(jù)行氣解郁,活血通絡(luò),軟堅(jiān)散結(jié)的功效組方而成。吳旭輝[24]以乳腺Ⅰ號(hào)治療沖任失調(diào)型乳腺增生,而蘇東瑋[25]以桂枝茯苓膠囊治療痰凝血瘀型乳腺增生癥,均有好的療效。對(duì)乳房的生理病理影響最大的是肝的藏血與疏調(diào)氣機(jī)[26]。本文挖掘的上述常用中藥材均歸肝經(jīng),可有效的治療肝失疏泄,氣機(jī)郁阻所致的脅痛、情志抑郁等癥,常配伍疏肝行氣藥;亦可治療肝郁血虛,脾失健運(yùn),婦女月經(jīng)不調(diào),乳房脹痛等,常配伍養(yǎng)血柔肝鍵脾藥。

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