肝蘇顆粒對(duì)膽總管阻塞性肝纖維化大鼠肝功能和病理?yè)p傷的影響

謝君，謝曉芳，李夢(mèng)婷，唐欣，熊秋韻，彭成

膽總管結(jié)扎手術(shù)是制備阻塞性肝纖維化動(dòng)物模型的方法[1]。肝蘇顆粒是由趕黃草制成的單味中成藥制劑，有研究表明趕黃草提取物可減輕膽汁淤積性肝纖維化[2]，本課題組前期發(fā)現(xiàn)肝蘇顆粒對(duì)CCL4導(dǎo)致的化學(xué)損傷性肝纖維化有治療作用[3]，現(xiàn)為探尋肝蘇顆粒對(duì)膽總管結(jié)扎致阻塞性肝纖維化疾病的預(yù)防及治療作用，為肝蘇顆粒的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供藥理理論依據(jù)，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎大鼠膽總管建立阻塞性肝纖維化模型，觀察肝蘇顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的防治作用及探討初步作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，體重180～220 g，雄性，SPF級(jí)，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-19。已通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)使用。

1.2 藥物與試劑

受試藥物：肝蘇顆粒浸膏，提供單位：四川古藺肝蘇藥業(yè)有限公司，5 g原生藥/mL，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水分別配制成1.67 g·mL-1備用；秋水仙堿片，由云南植物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20141103，使用前用生理鹽水配成0.01 mg·mL-1備用；水合氯醛，由成都市科龍化工試劑廠提供，批號(hào)20111123；ALT、AST試劑盒均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為150681、150611；TBIL、ALP、ALB、TP試劑盒均由四川邁克生物科技股份有限公司提供，批號(hào)1115121、0315071、1215061、1115031。

1.3 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)BECKMAN COULTER公司，型號(hào)AU5400）；低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)TDZ5-WS）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，VARIOSKAN FLASH）。電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)JA1003。

2 方法

2.1 造模及給藥

通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道[1]及預(yù)試驗(yàn)確定造模方法。取成年SPF級(jí)別SD雄性大，64只大鼠，待適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型對(duì)照組、秋水仙堿組和肝蘇顆粒組，每組15只，禁食不禁水12 h后進(jìn)行膽管結(jié)扎手術(shù)，具體方法：以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定，去腹部被毛后用碘伏、酒精消毒皮膚，在劍突下約2 cm處沿腹正中線切開(kāi)皮膚約3 cm，逐層打開(kāi)腹腔，在十二指腸和胃大彎處的大網(wǎng)膜內(nèi)找到膽總管，小心游離一段，將一鈍性針置于膽總管下，雙線結(jié)扎膽總管，然后逐層縫合腹膜、肌層和皮膚。假手術(shù)組暴露膽總管后即關(guān)腹，不行結(jié)扎。術(shù)后注射青霉素20萬(wàn)U/只抗感染。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中室內(nèi)溫度維持在25 ℃左右。于術(shù)后第2天開(kāi)始灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予生理鹽水10 mL/（kg·d）-1，肝蘇顆粒組灌胃藥液16.7 g·kg-1，秋水仙堿組灌胃秋水仙堿0.1 mg·kg-1。每日1次。當(dāng)肝組織出現(xiàn)明顯肝纖維化表現(xiàn)時(shí)終止試驗(yàn)，總時(shí)間不超過(guò)8周。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)及方法

末次給藥后，禁食不禁水12 h，然后以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，各組動(dòng)物股動(dòng)脈取血，約取3 mL于未加抗凝劑的采血管中。取血后，處死各組大鼠，每只大鼠剖取肝、脾、胸腺，稱濕重，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器濕重/體重×100%），取血離心后取血清采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和ALB水平，在同一肝葉位置切取小塊肝組織置入10%甲醛緩沖液固定，HE染色和Masson染色行病理組織學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS22.0軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式（ x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

除假手術(shù)組外，膽總管結(jié)扎大鼠于手術(shù)后1周內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)黃疸，表現(xiàn)為眼睛、耳朵、皮毛黃染，尿液顏色呈濃茶色。2周后，各給藥組黃疸癥狀減輕，活動(dòng)和進(jìn)食情況均較模型對(duì)照組好。解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組大鼠膽管結(jié)扎膽管管徑增粗，肝腫大，或區(qū)域變硬，點(diǎn)狀壞死；給藥組大鼠上述病變相對(duì)模型對(duì)照組輕。從體重看，自第2周起，模型對(duì)照組大鼠體重明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05或P＜0.01），而第4周起秋水仙堿組和肝蘇顆粒組大鼠體重均明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 肝蘇顆粒對(duì)膽管阻塞性肝纖維化大鼠體重的影響(x±s)

3.2 對(duì)膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝功能的影響

根據(jù)模型對(duì)照組大鼠肝功能的變化在第8周末結(jié)束試驗(yàn)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和球蛋白水平明顯升高，ALB含量及白球比值均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，秋水仙堿組和肝蘇顆粒組各給藥組血清ALT、AST、TBIL、ALP、DBIL及球蛋白含量均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），ALB含量及白球比值有增加。結(jié)果見(jiàn)下表2。

表2 肝蘇顆粒對(duì)膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠肝功能的影響(x±s)

3.3 對(duì)膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝，脾和胸腺臟器系數(shù)的影響

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的肝臟系數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性藥物組及肝蘇顆粒組可明顯降低肝臟系數(shù)，同時(shí)陽(yáng)性藥物組可降低脾臟系數(shù)，肝蘇顆粒及秋水仙堿組對(duì)胸腺系數(shù)無(wú)明顯作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 肝蘇顆粒對(duì)膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠臟器系數(shù)的影響(x±s)

3.4 對(duì)膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯微鏡下見(jiàn)假手術(shù)組肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)結(jié)締組織增生，無(wú)肝纖維化表現(xiàn)；模型對(duì)照組肝臟可見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少量肝細(xì)胞壞死灶和大量脂肪空泡，膽管上皮周圍膠原纖維沉積，形成纖維間隔，分隔改建原有肝小葉，出現(xiàn)輕至中度的纖維化，秋水仙堿組及肝蘇顆粒組肝臟纖維化程度與模型對(duì)照組比較病變有所減輕。結(jié)果見(jiàn)下圖1。

Masson染色發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，僅中央靜脈及匯管區(qū)血管壁著藍(lán)色，周圍有少量膠原纖維。模型對(duì)照組大鼠肝組織可見(jiàn)明顯的膽汁淤積，匯管區(qū)明顯著色，膠原纖維大量增生，纖維間隔增多增寬，并向肝小葉內(nèi)延伸，交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成完整的纖維間隔，分隔改建后形成假小葉。秋水仙堿組大鼠肝匯管區(qū)增生纖維較模型對(duì)照組纖細(xì)菲薄，細(xì)胞少見(jiàn)腫脹和壞死，未見(jiàn)完整假小葉形成，肝竇周圍少量著色。肝蘇顆粒組大鼠肝組織僅見(jiàn)少量殘留的膠原纖維痕跡和膽汁淤積，病變分布小灶性，病變均明顯輕于模型對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖2 肝蘇顆粒對(duì)膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠肝組形態(tài)學(xué)的影響（Masson染色，100×；A．假手術(shù)組；B．模型對(duì)照組；C．秋水仙堿組；D．肝蘇顆粒組）

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組評(píng)分明顯升高，差異有顯著性意義(P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較，各給藥組評(píng)分都降低，秋水仙堿組及肝蘇顆粒組可顯著降低肝纖維化評(píng)分（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)下表4。

表4 肝蘇顆粒對(duì)膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠肝臟纖維化變的影響(x±s)

4 討論

膽總管結(jié)扎致阻塞性肝纖維化模型與臨床上因膽汁分泌障礙，膽道阻塞所引起的肝纖維化病程相似[4]，因此該模型可以應(yīng)用在抗肝纖維化藥物篩選方面。通常將血清ALT與AST作為評(píng)判肝損傷程度的重要指標(biāo)[5]，同時(shí)有研究表明AST水平與肝纖維化進(jìn)展有相關(guān)性-[7]。TBIL和DBIL可作為膽汁淤積型肝損傷的檢查指標(biāo)[8]。當(dāng)膽汁排泄受阻時(shí)，血清ALP常與血清膽紅素相平行呈明顯升高趨勢(shì)[9]。ALB水平可以反映肝臟合成代謝和儲(chǔ)備功能，可以作為評(píng)估肝纖維化嚴(yán)重程度及判斷預(yù)后的指標(biāo)[4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP等來(lái)判斷肝損傷的程度，再結(jié)合HE染色、Masson染色從不同的角度來(lái)反映肝蘇顆粒對(duì)肝纖維化的作用。從本研究結(jié)果來(lái)看，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠血中ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平顯著升高，ALB水平明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.01或P＜0.05），提示該模型大鼠的膽道梗阻明顯，肝細(xì)胞功能受到損傷。與模型對(duì)照組比較，肝蘇顆粒組大鼠血清ALB有所升高，其余指標(biāo)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明肝蘇顆粒能降低膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠肝損傷程度，降低膽紅素的作用。HE染色和Masson染色病理結(jié)果顯示，肝蘇顆?？山档透闻K內(nèi)炎癥反應(yīng)和纖維化程度。

綜上所述，肝蘇顆粒能明顯改善膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠的肝功能和肝組織病理?yè)p傷，具有顯著療效。而本藥的治療機(jī)制和量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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