苗藥婦膚康噴霧劑的HPLC指紋圖譜研究Δ

廖秀，許晶晶，楊艷，李立郎，王科，李齊激#，楊小生（.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 55004；2.遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 56000；.貴州良濟(jì)藥業(yè)有限公司，貴州龍里55206）

婦膚康噴霧劑由爵床和千里光兩味藥材組成，為貴州省婦科用苗藥獨(dú)家品種，具有清熱解毒、活血止痛、殺蟲止癢的功效，主要用于霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎、細(xì)菌性陰道炎、外陰炎、皮膚瘙癢等婦科疾病的治療[1-4]。爵床作為君藥，是爵床科植物爵床的干燥全草，其主要成分為爵床定A、爵床定B、Cleistanthin-B、6′-羥基-爵床定B等為代表的木脂素類成分，在抗腫瘤、抗菌、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡等方面表現(xiàn)出較好的生物活性[5-11]，與該制劑“清熱解毒，活血止痛”的功效基本吻合。目前，該制劑及其君藥爵床現(xiàn)存標(biāo)準(zhǔn)僅以性狀與薄層色譜鑒別進(jìn)行質(zhì)量控制，無法全面地反映該制劑質(zhì)量。筆者在前期工作研究基礎(chǔ)上[12]，擬選6′-羥基-爵床定B和爵床定B為測定指標(biāo)，對10批婦膚康噴霧劑進(jìn)行研究，建立了婦膚康噴霧劑高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并測定了其中6′-羥基-爵床定B和爵床定B含量，以期為全面控制和評價(jià)該制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

U3000 HPLC儀，包括二元梯度泵、紫外檢測器色譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BS-210S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；AG285電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

婦膚康噴霧劑[貴州良濟(jì)藥業(yè)有限公司，批號：20150601～201506010（編號：S1～S10），規(guī)格 ：100 mL/瓶]；6′-羥基-爵床定B對照品（批號：2015011901，純度：＞98%）、爵床定B對照品（批號：2015011902，純度：＞98%）均由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC、質(zhì)譜、核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢測；乙腈、甲醇為色譜純，無水乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15 min，4%A；15～20 min，4%→15%A；20～25 min，15%→20%A；25～30 min，20%→25%A；30～40 min，25%→35%A；40～50 min，35%→60%A；50～55 min，60%→80%A；55～65 min，80%→90%A）；流速：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：262 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱量6′-羥基-爵床定B、爵床定B對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為1mg/mL的單一對照品溶液。取6′-羥基-爵床定B單一對照品溶液4 mL、爵床定B單一對照品溶液2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋，定容，得每1 mL分別含6′-羥基-爵床定B 40 μg、爵床定B 20 μg的混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 供試品溶液 吸取婦膚康噴霧劑樣品適量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 空白對照溶液 將等量的甲醇和70%乙醇溶劑混合均勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，6′-羥基-爵床定B和爵床定B與各雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)按6′-羥基-爵床定B計(jì)＞3 000?？瞻讓φ盏幕€平穩(wěn)，表明溶劑及流動相對爵床藥材的HPLC特征圖譜檢測基本無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12 mL，精密配制成每1 mL分別含6′-羥基-爵床定B 8、16、24、32、40、48 μg/mL和爵床定B 4、8、12、16、20、24 μg/mL的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of linear relationship investigation（n＝6）

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（編號：S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以6′-羥基-爵床定B的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD＜2.0%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品（編號：S1）適量，共6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入6′-羥基-爵床定B 1.250 0 mg、爵床定B 0.500 0 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

表2結(jié)果顯示，6′-羥基-爵床定B和爵床定B平均加樣回收率分別為98.88%、98.65%，RSD分別為0.83%、0.95%，其結(jié)果在95%～105%之間，表明加樣回收率良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成及共有峰相關(guān)分析 分別取編號為S1～S10樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得到10批次噴霧劑樣品的HPLC色譜圖。將10批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版），以S1號樣品圖譜為校正圖譜，采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動匹配，生成10批樣品指紋圖譜疊加模式（圖2）及對照指紋圖譜（圖3），確定10批樣品的共有峰為12個。根據(jù)保留時間指認(rèn)圖譜中10號峰為6′-羥基-爵床定B，12號峰為爵床定B。以10號峰為參照峰，計(jì)算其他特征峰相對于10號峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3、表4。

圖2 10批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖3 婦膚康噴霧劑樣品HPLC對照指紋圖譜Fig 3 HPLC control fingerprints of Fufukang spray

表3 10批樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間Tab 3 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.4.2 相似度分析 將共有峰模式的對照指紋圖譜及10批噴霧劑樣品圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版），采用相關(guān)系數(shù)法對樣品的相似度進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果，S1～S10相似度分別為0.947、0.987、0.989、0.988、0.909、0.913、0.925、0.901、0.927、0.929，均＞0.90，說明10批樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性[13]。

表4 10批樣品HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of samples

2.5 6′-羥基-爵床定B、爵床定B的含量測定

分別取S1～S10樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，10批樣品中 6′-羥基-爵床定 B 含量依次為 3.34、3.54、3.64、2.92、2.93、2.95、2.44、1.64、4.02、5.84 mg/100 mL；爵床定B 含量依次為 1.46、1.63、1.96、1.39、1.50、1.50、1.34、0.83、1.62、2.78 mg/100 mL。

3 討論

筆者前期試驗(yàn)通過對檢測波長、流動相、流速、柱溫等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，對婦膚康噴霧劑樣品進(jìn)行紫外（200～400 nm）全波長掃描，在262 nm波長處出峰較多，且檢測成分6′-羥基-爵床定B和爵床定B在此波長下吸光值最大，故選262 nm為檢測波長。隨后分別對乙腈-水、甲醇-水、不同濃度的冰醋酸/甲酸-乙腈等流動相進(jìn)行了前期的預(yù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示在相同的條件下，乙腈-水作為流動相分離效果好，但基線不平穩(wěn)；乙腈-0.2%冰醋酸為流動相，分離效果更好，基線更平穩(wěn)，峰形更好，最終確定乙腈-0.2%冰醋酸為流動相，在此條件下又分別對流速、柱溫等色譜條件進(jìn)行考察，最終確定色譜條件為262 nm為檢測波長、體積流量0.6 mL/min、柱溫25℃、乙腈-0.2%冰醋酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

通過對10批樣品指紋圖譜分析，得到不同樣品之間的相似度均在0.90以上，并標(biāo)定了12個共有峰，各個色譜峰的保留時間匹配較好，說明不同批次樣品中的化學(xué)成分類型一致[14-15]。通過測定樣品中6′-羥基-爵床定B和爵床定B的含量發(fā)現(xiàn)，10批樣品中6′-羥基-爵床定B含量為1.64～5.84 mg/100 mL，爵床定B含量為0.83～2.78 mg/100 mL，不同批號間兩種檢測指標(biāo)的含量存在較大差異，這可能是由于生產(chǎn)原料不穩(wěn)定引起的。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地爵床藥材中成分差異較大，且6′-羥基-爵床定B和爵床定B含量具有較大差異[12]，建議生產(chǎn)該制劑時，盡量選擇同一產(chǎn)地的藥材。但是也有可能是由于生產(chǎn)前對樣品提取不當(dāng)或生產(chǎn)線上其他原因引起的，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，本研究所建立的方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為婦膚康噴霧劑的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

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