鴨瘟病毒感染的診斷與病毒分離鑒定

李小倫

鴨瘟（ Duck plague，DP）俗稱“大頭瘟”，又名鴨病毒性腸炎（ Duck viral enteritis， DVE），是由鴨瘟病毒（ Duck plague virus，DPV）引起的一種急性、敗血性及高度致死性的傳染病。本病的特征是體溫升高，病鴨腫頭流淚，下痢，食道黏膜出血或壞死，兩腿麻痹，排出綠色稀糞，剖檢特征可見心臟表面有針尖大小的出血點，肝臟腫大明顯，呈土黃色，質脆，肝臟表面有針尖大灰色壞死灶和出血點，膽囊腫大，脾腫大，肺充血、出血和壞死，咽喉部有黏液、氣管內有少量漿液性分泌物。本病流行廣泛，該病一旦發(fā)生，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，能夠造成非常大的經(jīng)濟損失，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最主要疫病之一。加強鴨瘟病毒診斷對預防和控制本病都具有重要的現(xiàn)實意義，本文通過對養(yǎng)殖場發(fā)生的一例鴨瘟病毒感染的診治，以期為廣大養(yǎng)殖戶提供參考，現(xiàn)將整個診治過程介紹如下。

1材料和方法

1.1主要試劑與試劑盒

pMD18-T克隆載體購自寶生物（大連）有限公司；病毒基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2臨床診斷

1.2.1臨床癥狀 觀察發(fā)病鴨的臨床癥狀。

1.2.2病理變化對病死鴨解剖，觀察病理變化。

1.3實驗室PCR檢測

1.3.1病料樣品的處理無菌采集病鴨的病變組織，研磨后反復凍融3次，離心取上清液即得處理后的病料樣品。1.3.2引物設計與合成根據(jù)參考文獻合成1對鴨瘟特異性檢測引物（上游引物P1：5-CGACTACA TCCA TACC CACT-3；下游引物P2：5- TATGCTTC AGCT ACAC TA-3，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增取處理后的病料樣品0.2mL，利用病毒基因組提取試劑盒提取DNA后進行PCR擴增，PCR擴增程序為：95℃5min；95℃30s， 47℃30s， 72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4病毒分離與鑒定

1.4.1病毒的增殖取處理后的病料樣品2.OmL經(jīng)0.45 ym濾器過濾除菌后，絨毛尿囊膜途徑接種10日齡鴨胚10枚，120h后收集含痘斑的鴨胚尿囊膜和鴨胚尿囊液，經(jīng)鴨胚尿囊膜剪碎并用尿囊液制成懸液，12000r/min離心15min，取上清液，-20℃保存。

1.4.2分離毒株PCR鑒定取保存的病毒液0.2mL，按照1.3.3的方法進行PCR擴增與檢測。

1.4.3核酸序列測定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化，連接至pMD18-T克隆載體，質粒提取試劑盒提取重組質粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2結果與分析

2.1發(fā)病鴨臨床癥狀

病鴨初期表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，之后排黃綠色稀便，眼瞼水腫，頭部腫大，雙翅下垂，兩腿麻痹，不愿走動，發(fā)病3～5d死亡。

2.2發(fā)病鴨病理剖檢

剖檢可見鴨肝表面以及切面有大小不等的灰白色壞死點及小出血點，喉頭及氣管黏膜充血，咽喉部及氣管有黏液性分泌物，腺胃、肌胃、脾臟和腎臟呈出血性壞死，肺臟出血水腫，頭頸部皮下組織膠樣浸潤。2.3病料PCR檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，在位于510bp處可見特異性DNA擴增條帶，與預期大小相符。

2.4病毒增殖

鴨胚接種后96—120h死亡，鴨胚全身有點狀出血和水腫，鴨胚尿囊膜增厚，出現(xiàn)白色痘斑。

2.5孩酸序列測定

測序結果經(jīng)過Blast序列比對，表明插入到pMD18-T載體的基因片段的核苷酸序列為鴨瘟病毒的特異性序列，通過分子生物學手段進一步證明該鴨場發(fā)生了鴨瘟病毒感染，為發(fā)病鴨場的疾病防控提供有力的技術保障。

3討論

鴨瘟是一種傳染性強、死亡率高的疾病，潛伏期一般為3～7d，感染鴨表現(xiàn)出精神不振，頭頸部會成縮起的狀態(tài)，病鴨喜歡獨處，并比較喜歡飲水，發(fā)病初期會表現(xiàn)厭食和消瘦，眼瞼腫脹，在出現(xiàn)癥狀后的3～ 5d內就會死亡，鴨瘟的早期癥狀有利于及時的發(fā)現(xiàn)并采取防控措施。本文通過對發(fā)病鴨場疑似鴨瘟癥狀的病鴨進行臨床和實驗室診斷，最終通過PCR檢測、病毒分離和測序鑒定確定該鴨場發(fā)生了鴨瘟疫情，為發(fā)病鴨場找到了致病原，對有效控制該病的發(fā)生及傳播具有重要意義。鴨場發(fā)生鴨瘟病毒感染后，要加強鴨群的日常飼養(yǎng)管理，加強免疫抑制病的防控，防止鴨瘟與其它細菌病和病毒病的繼發(fā)感染，加強飼料的營養(yǎng)，提高鴨群的整體免疫力，注意鴨舍內的通風，減少各類不良應激的發(fā)生，為防控鴨瘟的發(fā)生大有裨益。鴨瘟病毒感染一般呈零星發(fā)病，規(guī)模養(yǎng)殖場做好鴨瘟的免疫接種一般不會發(fā)生大規(guī)模的暴發(fā)和流行，由于鴨瘟活疫苗的免疫周期短，免疫效果不夠持久，所以建議規(guī)?；唸隹梢愿鶕?jù)鴨體內的抗體監(jiān)測水平進行免疫，鴨瘟高發(fā)地區(qū)可以聯(lián)合應用活苗和滅活疫苗。根據(jù)鴨瘟的傳染特點，發(fā)病初期要切斷傳染源，一旦發(fā)生鴨瘟疫情要及早隔離發(fā)病鴨，防止鴨瘟病毒擴散傳播，注射相應的血清，這是最好的對癥療法。同時可選擇用抗生素、抗病毒類藥物和清熱解毒類中藥劑等進行輔助治療，可有效降低感染后的死亡率。

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