懷山藥內(nèi)生真菌的分離與鑒定

文春南 王曉龍 李守婷 張朋展 葉穎曉 麻兵繼

摘要：以懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）為試驗(yàn)材料，采用組織塊分離法和研磨分離法對懷山藥根莖中內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，并運(yùn)用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，共分離得到23株真菌，經(jīng)鑒定分別為鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、地霉菌屬（Geotrichum）、彎孢菌屬（Curvularia）和鏈格孢屬（Alternaria）等6個(gè)屬。

關(guān)鍵詞：懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）；內(nèi)生真菌；分子生物學(xué)方法；鐮孢菌

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0058-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.015

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Dioscorea opposita Thunb

WEN Chun-nan，WANG Xiao-long，LI Shou-ting，ZHANG Peng-zhan，YE Ying-xiao，MA Bing-ji

（College of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The rhizome of Dioscorea opposita Thunb was used as the experimental material，and then endophytic fungi were isolated by the methods of tissue and grinding separation. The isolated strains were then identified by morphology and molecular biology approaches. The results showed that 23 strains from D. opposita Thunb were identified，which belonged to 6 genera，namely，F(xiàn)usarium，Penicillium，Aspergillus，Geotrichum，Curvularia and Alternaria.

Key words： Dioscorea opposita Thunb； endophytic fungi； molecular biology approaches； Fusarium

懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）為薯蕷科多年生植物薯蕷的根狀莖，自古以來即是河南省著名的“四大懷藥”之一，具有健脾胃、益肺腎、止痢疾、化痰涎等功效，又被稱為“懷參”[1]。藥典收載的懷山藥的藥材生產(chǎn)具有明顯的地域性，即河南懷慶府（古懷慶府即今河南省焦作一帶，含博愛、武陟、沁陽、溫縣等地）為主要產(chǎn)地[2]。鑒于懷山藥具有藥食兼用的功效且口感好，國內(nèi)外市場對懷山藥的需求量巨大。當(dāng)前對懷山藥的文獻(xiàn)研究多集中于藥材人工栽培及其生物功能等方面，而人工栽培的研究又主要集中在懷山藥的外部生長環(huán)境研究，即氣候因子、光照、溫度、土壤、水分等[3，4]，對懷山藥植株內(nèi)環(huán)境如內(nèi)生真菌的研究較少。植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史中某一段時(shí)期生活在活的植物組織內(nèi)，對宿主植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌[5]。雖然中藥材內(nèi)生真菌和藥材質(zhì)量之間存在密切聯(lián)系，是藥材道地性形成的關(guān)鍵因子之一，相關(guān)研究文獻(xiàn)也較多[6，7]。但懷山藥內(nèi)生真菌與藥材品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性尚缺乏研究。因此，本研究從懷山藥的內(nèi)生真菌分離鑒定著手，分析懷山藥內(nèi)生真菌的多樣性，為今后系統(tǒng)研究內(nèi)生真菌與懷山藥品質(zhì)及道地性之間的關(guān)系提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 供試植株樣品為河南省焦作市溫縣農(nóng)科所懷山藥試驗(yàn)基地采集的健壯懷山藥植株，品種為鐵棍山藥。

1.1.2 分離純化培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g、去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和純化 將懷山藥切成小段，取懷山藥一小段根用無菌水反復(fù)清洗至樣品表面徹底干凈，再依次用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸取表面多余水分，并以最后一次沖洗過的無菌水200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基平板上作為空白對照，以檢測樣品表面的滅菌效果[8]。放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5～15 d，觀察培養(yǎng)皿中材料切口處長出菌絲（菌落），待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及出現(xiàn)新菌時(shí)間的不同，分別用無菌牙簽挑取各平板菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接于新的空白PDA培養(yǎng)基上，按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2～3代，以確保純化獲得單一菌株。

1.2.2 內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)純化得到的真菌菌落培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型以及孢子的形態(tài)、顏色、大小進(jìn)行初步分類鑒定。

1.2.3 內(nèi)生真菌分子鑒定 內(nèi)生真菌DNA提?。簠⒄照婢蚪MDNA小量提取試劑盒步驟進(jìn)行操作，得DNA溶液，于-20 ℃冰箱中保存、備用。

rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，Premix Taq 25 μL，ITS1（20 μmol/L）2 μL，ITS4（20 μmol/L）2 μL，ddH2O 19 μL，DNA模版2 μL，上游引物ITS1：5′-TC

CGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4：5′-TC

CTCCGCTTATTGAATGC-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL。

PCR擴(kuò)增程序（每份擴(kuò)增產(chǎn)物平行3份）：預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，1 min，復(fù)性49 ℃，1 min，延伸72 ℃，2 min，30個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃，10 min；4 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，1×TAE電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，EB染色5 min，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。檢測后置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

內(nèi)生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行NCBI BLAST比對分析，采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA ver. 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中系統(tǒng)進(jìn)化矩陣按Kimura 2-Parameter模型估算，采用鄰接法（Neighbor-Joining）聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣 1 000次進(jìn)行自展值（Bootstrap value）分析，評估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。定義16S rDNA序列相似性大于98%為同一個(gè)物種[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離

通過組織分離法從懷山藥根中共分離得到23株真菌，經(jīng)鑒定為6個(gè)屬，分別為鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、地霉菌屬（Geotrichum）、彎孢菌屬（Curvularia）和鏈格孢屬（Alternaria）。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的內(nèi)生真菌依次進(jìn)行菌落特征和顯微觀察。如菌株Doef-1，菌絲茂密豐富，棉絮狀，白色至乳黃色；有大量分生孢子，鍥形至梭狀鐮刀形；隔膜明顯，多數(shù)為3個(gè)隔膜，少量有4～6個(gè)隔膜；厚垣孢子生于分生孢子?；蚓z短枝的頂端，球形至卵形。按照魏景超[9]的方法初步認(rèn)為菌株Doef-1為鐮刀菌屬（Fusarium）真菌。

2.3 分子學(xué)鑒定

2.3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果 對分離得到的內(nèi)生真菌提取DNA，然后進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，在550 bp處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶，條帶大小與預(yù)期目標(biāo)一致。

2.3.2 rDNA-ITS序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 進(jìn)一步測序結(jié)果顯示23個(gè)菌株的rDNA-ITS片段大小為500～550 bp，將所獲得的內(nèi)生菌rDNA-ITS片段與NCBI中已知序列進(jìn)行Blast比對，結(jié)果見表1。

對比分離得到的23株內(nèi)生真菌與其同源性相似的已知16S DNA序列，挑取相似性在97%以上的菌株，利用MEGA 5.0和Clustal X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

由表1及圖1可知，糞殼菌綱為優(yōu)勢類群，占內(nèi)生真菌總數(shù)的40%，分離得到的9個(gè)菌株（Doef-1、Doef-2、Doef-5、Doef-8、Doef-10、Doef-14、Doef-18、Doeb-19、Doef-20）分屬糞殼菌綱的1個(gè)屬（Fusarium）；7個(gè)菌株（Doef-3、Doef-4、Doef-6、Doef-7、Doef-9、Doef-12、Doef-16）分屬散囊菌綱的2個(gè)屬（Aspergillus、Penicillium）；6個(gè)菌株（Doef-11、Doef-13、Doef-17、Doef-21、Doef-22、Doef-23）為座囊菌綱的2個(gè)屬（Curvularia、Alternaria）；半子囊菌綱則分離得到1個(gè)屬（Geotrichum）的1個(gè)菌株（Doeb-4）。其中內(nèi)生真菌主要分布在鐮孢菌屬（Fusarium），為懷山藥內(nèi)生真菌中優(yōu)勢菌群。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)分離得到23株真菌，經(jīng)鑒定為6個(gè)屬。張志東等[11]從山藥根中分離到10株內(nèi)生細(xì)菌并鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）和歐文氏菌屬（Erwinia），沒有分離到內(nèi)生真菌，這可能與所選用的山藥品種不同有關(guān)。張建新等[12]用涂布平板法從鐵棍山藥分離到32株內(nèi)生菌，有4株真菌，28株細(xì)菌，其中篩選到了11株內(nèi)生細(xì)菌對白菜軟腐菌有拮抗作用，但沒有對這些內(nèi)生菌鑒定到屬。與上述文獻(xiàn)報(bào)道不同，本試驗(yàn)所用懷山藥樣品采于河南省焦作市溫縣（懷山藥產(chǎn)地之一），不同于市售山藥，因而分離到的內(nèi)生真菌種類較多。

懷山藥道地性的形成非常復(fù)雜，其道地性的科學(xué)機(jī)制闡明必然是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)作為懷山藥道地性系統(tǒng)研究的一部分，研究結(jié)果豐富了懷山藥內(nèi)生真菌的種類和資源，填補(bǔ)了懷山藥內(nèi)生真菌研究的空白。為今后進(jìn)一步研究內(nèi)生真菌與懷山藥道地性之間的關(guān)聯(lián)作用，如內(nèi)生菌是否具有促進(jìn)藥材生長發(fā)育、增強(qiáng)藥材抗逆性及促進(jìn)懷山藥藥材有效成分積累等作用的研究提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李時(shí)珍.本草綱目（上冊）[M].長春：時(shí)代文藝出版社，2004.

[2] 尚志鈞.新修本草[M].合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1981.

[3] 柳運(yùn)民.懷山藥栽培及病蟲害防治[J].河南農(nóng)業(yè)，2009（1）：39.

[4] 饒鋮樂，朱玉端，徐國俊，等.懷山藥多糖提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2012，48（6）：61-63，73.

[5] 陳 龍，梁子寧，朱 華.植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（8）：30-34.

[6] 江 曙，錢大瑋，段金廒，等.植物內(nèi)生菌與道地藥材的相關(guān)性研究[J].中草藥，2008，39（8）：1268-1272.

[7] 馬 昭，唐承晨，張 純，等.內(nèi)生菌與宿主植物關(guān)系對中藥材道地性研究的啟示[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，29（6）：4-11.

[8] 周 鳳，張弘弛，劉 瑞，等.恒山黃芪內(nèi)生真菌分離鑒定及抗菌活性的研究[J].食品科技，2012，37（1）：22-25，28.

[9] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[10] DEVEREUX R，HE S H，DOYLE C L，et al. Diversity and origin of desulfovibrio species： Phylogenetic definition of a family[J].J Bacteriol，1990，172（7）：3609-3619.

[11] 張志東，謝玉清，楚 敏，等.山藥內(nèi)生菌的分離及菌種鑒定研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（1）：126-129.

[12] 張建新，劉起麗，趙丹丹，等.鐵棍山藥內(nèi)生菌的分離及對白菜軟腐菌拮抗菌的篩選[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（10）：94-96.